马齿苋水提物不同组分促进小鼠小肠推进活性筛选△

袁淑青，吴春珍，胡高达，张奇，刘英

(国药集团 国药健康产业研究院有限公司，上海 201203)

马齿苋水提物不同组分促进小鼠小肠推进活性筛选△

袁淑青，吴春珍，胡高达，张奇，刘英*

(国药集团 国药健康产业研究院有限公司，上海 201203)

目的：为了揭示马齿苋药材中具有润肠通便功能的药效物质。方法：采用水提醇沉的方法制备马齿苋总多糖和生物碱，并使用三氯甲烷和正丁醇的混合液脱除多糖中蛋白质得到脱蛋白多糖，再使用AB-8大孔吸附树脂分离上清液中低极性成分和高极性成分。制备洛哌丁胺致肠蠕动抑制模型小鼠，采用碳墨推进法，通过测定马齿苋各活性组分模型小鼠小肠推进的百分率及脱蛋白多糖正常小鼠小肠推进百分率进行筛选和评价。结果：制备得到马齿苋多糖、马齿苋脱蛋白多糖、马齿苋生物碱、水提醇沉上清液中低极性成分和高级性成分；小鼠小肠推进实验结果显示，马齿苋多糖及脱蛋白多糖对肠蠕动抑制模型小鼠的小肠推进有促进作用，而且马齿苋脱蛋白多糖对正常小鼠、模型小鼠小肠推进均有促进作用，且呈良好的量效关系。结论：马齿苋药材中具有润肠通便功能的药效物质为多糖成分。

齿苋；活性组分；脱蛋白多糖；小肠推进

《中药大辞典》中记载[1]，马齿苋PortulacaoleraceaL.为马齿苋科马齿苋属植物马齿苋的全草，又名五行草、长寿菜等，适应性强，分布广泛。大量研究发现，马齿苋中含有多种生理活性物质，包括多糖类、有机酸类、黄酮类、生物碱类、萜类、氨基酸、维生素以及矿物质等[2-5]。现代药理研究表明[6-9]，马齿苋具有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤以及润肠通便等功能。本实验室前期研究结果表明，马齿苋水提物具有润肠通便功能，与文献报道一致。因此，本研究进一步考察马齿苋粗多糖、脱蛋白多糖、生物碱、水洗脱组分和醇洗脱组分对小鼠肠推进的影响，以揭示其润肠通便的药效物质。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1.2 材料

马齿苋(上海雷允上药业有限公司，批号：LY1408039)；盐酸洛哌丁胺(西安杨森制药有限公司，规格：2 mg，批号：140313152)；通便胶囊(浙江金诺康生物制药有限公司，规格：0.45 g，批号：G20130569)；羧甲基纤维素钠(重庆力宏精细化工有限公司，批号：4040109)；活性炭粉(西陇化工股份有限公司，批号：20150230)；AB-8型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；工业乙醇、丙酮、无水乙醚、盐酸、氢氧化钠、氨水、三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)。

昆明种小鼠(清洁级，雄性，18～22 g)，购自上海复旦大学医学院实验动物科学部，许可证号码为SCXK(沪)2014-0004。

2 方法

2.1 马齿苋各组分制备

2.1.1 粗多糖的制备 取马齿苋药材200 g，加入15倍体积蒸馏水，浸泡4 h，回流提取2次，每次1.5 h，经200目滤膜过滤、合并滤液、减压浓缩制得水提浓缩液。在浓缩液中缓慢加入95%工业乙醇，使醇含量达到80%左右，置于4 ℃的冰箱中沉淀分离24 h，分别抽滤分离收集上清液与离心分离下层沉淀。沉淀物依次经无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤数次，以除去残留色素等杂质，真空干燥，制得马齿苋粗多糖，计算得率。

2.1.2 脱蛋白多糖的制备 取适量马齿苋粗多糖，用蒸馏水溶解、混匀，按照料液体积比为3∶1加入三氯甲烷和正丁醇(6∶1)的混合液，振摇，离心，取水相，重复上述步骤5次，得到精制多糖上清液，减压浓缩后，冷冻干燥，制得脱蛋白多糖，计算得率。

权重分配的合理与否将直接影响到评价结果的准确性［5］。根据评价指标对普查工作战略目标的重要性应分别赋予不同的权重。采用AHP法［6］，通过一致性检验的即为该权重；未通过一致性检验的指标反馈给专家，重新进行两两对比，直到所有的指标的权重都通过一致性检验。最后将所有专家得出的权重求权重算术平均值，得出的指标体系的权重的结果见表1。

2.1.3 生物碱的制备 取马齿苋水提醇沉上清液，用36%～38%盐酸溶液调节其pH为3～4，搅拌均匀，抽滤，收集滤液。用10%氨水溶液调节滤液pH为9～10，搅拌均匀，用三氯甲烷进行萃取，重复2次，合并三氯甲烷萃取液，减压回收三氯甲烷，制得马齿苋生物碱，计算得率。

2.1.4 水洗脱组分和醇洗脱组分的制备 取适量马齿苋水提醇沉上清液，稀释至一定浓度，超声使均匀；调节吸附柱内液面高度，一次性加入上样液，上样流速为5 mL·min-1，上样液缓慢浸入大孔吸附树脂至液面贴近树脂平面，分别用5倍柱体积蒸馏水和70%乙醇洗脱，洗脱速度为10 mL·min-1，合并洗脱液，经减压浓缩、冷冻干燥，制得AB-8水洗脱组分和70%乙醇洗脱组分，计算得率。

2.2 药物配制

2.2.1 10%碳墨混悬液的配制 称取羧甲基纤维素钠(CMC-Na)2 g，加蒸馏水150 mL煮沸至透明，称取活性碳粉20 g加入上述溶液中煮沸3次，待溶液凉后定容到200 mL，于冰箱中4 ℃保存，用前摇匀。

2.2.2 洛哌丁胺混悬液的配制 洛哌丁胺剂量为10 mg·kg-1。将胶囊内容物研碎呈粉末后用1% CMC-Na溶液配制0.5 mg·mL-1的混悬液，充分摇匀后使用。

2.2.3 受试物溶液配制 将通便胶囊内容物1.1 g、马齿苋粗多糖1.3 g、马齿苋脱蛋白多糖0.9 g、生物碱0.003 g、水洗组分0.03 g、醇洗组分0.06 g，分别用10%碳墨混悬液配成相应浓度，充分混匀，现配现用。

2.3 马齿苋各组分对肠蠕动抑制模型小鼠小肠推进的影响

取雄性昆明种小鼠(18～22 g)，随机分为正常组、模型组、阳性对照组、粗多糖组、脱蛋白多糖组、生物碱组、水洗组分组、醇洗组分组，每组10只。实验前各组小鼠禁食不禁水20 h，正常组灌胃给予1% CMC-Na溶液，其余各组均灌胃给予盐酸洛哌丁胺溶液(10 mg·kg-1)，给药体积均为20 mL·kg-1，30 min后，正常组和模型组灌胃给予10%碳墨混悬液，其余各组小鼠均灌胃给予含相应浓度受试样品的10%碳墨混悬液，给药体积均为0.5 mL/只，各受试溶液组小鼠的给药剂量均相当于《中华人民共和国药典》规定人用最大生药剂量的50倍；25 min后，脱颈椎处死动物，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按公式(1)计算墨汁推进率。

(1)

2.4 脱蛋白多糖对正常小鼠小肠推进影响的量效关系

取雄性昆明种小鼠(18～22 g)，随机分为正常组、阳性对照组、脱蛋白多糖低剂量组(0.4 g·kg-1)、脱蛋白多糖中剂量组(0.8 g·kg-1)、脱蛋白多糖高剂量组(1.6 g·kg-1)，每组10只。实验前各组小鼠禁食不禁水20 h，正常组灌服10%碳墨混悬液，脱蛋白多糖各组灌胃给予含相应浓度受试样品的10%碳墨混悬液，给药体积均为0.5 mL/只，25 min后脱颈椎处死动物，按前述方法测定肠管长度，并计算墨汁推进率。

2.5 脱蛋白多糖对肠蠕动抑制模型小鼠小肠推进影响的量效关系

取雄性昆明种小鼠(18～22 g)，随机分为正常组、模型组、阳性对照组、脱蛋白多糖低剂量组(0.4 g·kg-1)、脱蛋白多糖中剂量组(0.8 g·kg-1)、脱蛋白多糖高剂量组(1.6 g·kg-1)，每组10只。实验前各组小鼠禁食不禁水20 h，正常组灌胃给予1% CMC-Na溶液，其余各组均灌胃给予盐酸洛哌丁胺溶液(10 mg·kg-1)，给药体积均为20 mL·kg-1，30 min后，正常组和模型组灌胃给予10%碳墨混悬液，其余各组小鼠均灌胃给予含相应浓度受试样品的10%碳墨混悬液，给药体积均为0.5 mL/只，25 min后、脱颈椎处死动物，按前述方法测定肠管长度，并计算墨汁推进率。

2.6 数据统计与分析

3 结果

3.1 马齿苋各活性组分制备

按照2.1中方法制备马齿苋粗多糖得率为20.5%(以生药计)，脱蛋白多糖为14.0%(以生药计)，生物碱得率为0.04%(以生药计)，水洗组分和醇洗组分得率分别为0.49%(以生药计)和0.94%(以生药计)。

3.2 马齿苋各活性组分对肠蠕动抑制模型小鼠小肠推进的影响

表1数据表明，模型组小鼠的小肠推进率显著低于正常组(P<0.01)，说明小鼠肠蠕动抑制模型制备成功；与模型组比较，阳性对照组小鼠的小肠推进率显著高于模型组(P<0.05)，粗多糖组与脱蛋白多糖小肠推进率显著高于模型组(P<0.01)。

表1 马齿苋各活性组分对肠蠕动抑制模型小鼠小肠推进的影响

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 脱蛋白多糖对正常小鼠肠推进影响的量效关系

表2结果显示脱蛋白多糖中、高剂量组与正常组比较均有统计学差异(P<0.01)，表明脱蛋白多糖有促进正常小鼠小肠推进的作用，且促进作用随着剂量增大而增强，呈现剂量依赖关系。

表2 脱蛋白多糖对正常小鼠小肠推进影响的量效关系

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 脱蛋白多糖对肠蠕动抑制模型小鼠肠推进影响的量效关系

表3结果表明，与正常组相比，模型组小鼠的小肠推进率显著降低(P<0.01)，证明小鼠肠蠕动抑制模型复制成功；与模型组相比，阳性对照组小鼠的小肠推进率显著增加(P<0.05)，马齿苋脱蛋白多糖低、中、高剂量组小鼠的小肠推进率均显著高于模型组，且促进小肠推进作用呈现明显的剂量依赖关系。

表3 脱蛋白多糖对肠蠕动抑制模型小鼠肠推进影响的量效关系

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

有研究证实[10-11]，马齿苋可修复溃疡性结肠炎(UC)模型小鼠的组织损伤，缓解功能性胃肠病患者的各种临床症状等。本实验室前期研究表明，马齿苋水提物可促进小鼠肠推进，目前文献没有报道马齿苋润肠通便的物质基础，也没有报道马齿苋多糖具有促进小肠推进作用。

通过本实验发现，马齿苋脱蛋白多糖对正常小鼠也具有一定的促进小肠推进作用，对肠蠕动抑制模型小鼠小肠推进促进作用更加显著。另外，马齿苋脱蛋白多糖的肠推进的促进作用呈良好的量效关系。据文献报道[12-13]，黑木耳多糖可促进正常小鼠的肠胃运动，并拮抗新斯的明所致肠胃功能亢进；锁阳多糖对小鼠肠推进具有明显的促进作用，并且可以拮抗由阿托品引起的小鼠肠蠕动的抑制。文献没有报道马齿苋多糖，特别是马齿苋脱蛋白多糖对小鼠小肠推进的促进作用，有关小肠推进的促进作用机制有待进一步研究。

本研究的发现为评价马齿苋的润肠通便功能提供依据，也揭示了马齿苋多糖为马齿苋润肠通便的物质基础，为开发马齿苋润肠通便药物或保健品奠定了药效物质基础。

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PreparationofActiveIngredientsfromPortulacaoleraceaandScreeningofTheirActivitiesonIntestinalPropulsion

YUAN Shuqing，WUChunzhen，HUGaoda，ZHANGQi，LIUYing*

(SinopharmHealthIndustryResearchCo.Ltd，Shanghai201203，China)

Objective：To elucidate the pharmacodynamic substances of smoothing intestine and relieving constipation inPortulacaoleracea.Methods：The water extraction and alcohol precipitation method was used to prepare the total polysaccharides and alkaloids，and a mixture of chloroform andn-butanol used to obtain removing protein polysaccharides.Meanwhile，the low polarity components and high polarity components were prepared by AB-8 macroporous resin.The loperamide-induced peristaltic inhibition model in mice was reproduced by measurement of carbon ink propulsion and used to screen the ingredients.Results：five active components fromP.oleraceaL were obtained and only total polysaccharides and removing protein polysaccharides showed to be potent on intestinal propulsion in mice，in which the removing protein polysaccharides were more potent.Conclusion：The pharmacodynamic substances of smoothing intestine and relieving constipation inP.oleraceaare polysaccharide components.

Portulacaoleracea；active components；removing protein polysaccharides；intestinal propulsion

上海市卫生与计划生育委员会资助项目(ZY3-FWMS-1-1001-KYJS-49，2014—2016)

] 刘英，硕士生导师，研究员，研究方向：药理研究；Tel：(021)2057000-8787，E-mail：liuyingsipi@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.015

2016-11-01)

*[