珍珠水解液的美白作用机理研究

邓云云，王笑月，李才广，孟宏，董銀卯，李丽*

(1.海南京润珍珠生物技术股份有限公司，海南 海口 570100；2.北京工商大学 理学院，北京 100048)

珍珠水解液的美白作用机理研究

邓云云1，王笑月2，李才广1，孟宏2，董銀卯2，李丽2*

(1.海南京润珍珠生物技术股份有限公司，海南 海口 570100；2.北京工商大学 理学院，北京 100048)

目的：通过人的黑色素细胞实验研究珍珠水解液的美白作用机理。方法：NaOH法测定黑色素细胞黑色素含量，实时荧光定量PCR法(RT-PCR)测定珍珠水解液对影响黑色素合成的相关基因酪氨酸酶基因(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)及影响黑色素转运的相关基因小眼畸形相关转录因子(MITF)。结果：浓度为0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液可以抑制黑色素细胞的黑色素合成，3种浓度下的珍珠水解液均可抑制相关基因TRP1 mRNA的表达，0.25%浓度下可抑制TYR、TRP1及MITF的mRNA的表达。结论：珍珠水解液主要通过抑制黑色素合成过程中TRP1 mRNA的表达，从而抑制黑色素合成而发挥美白功效。

珍珠水解液；酪氨酸酶基因；酪氨酸酶相关蛋白1；小眼畸形相关转录因子；黑色素含量；美白机制

珍珠是由珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteriamartensii和蚌科动物三角帆蚌Hyriopsiscumingii和褶纹冠蚌Cristariaplicata的外套膜受刺激后的分泌物聚集而成，有安神定惊、明目消翁、解毒生肌的功能，主治惊悸失眠、惊风癫痛、目赤翳障、疮疡不敛[1-2]。珍珠粉富含人体需要的多种蛋白质及角蛋白肽类、多种氨基酸、24种微量元素和钙等多种有效成分，具有抗疲劳、明显降低过氧化酯作用，从而起到养颜护肤、延缓衰老之功效[3]，因而常被用作高级补养品和高档化妆品的原料[4-5]。

研究表明，珍珠可通过抑制酪氨酸酶而发挥美白作用[6]，但对其具体的美白作用机制尚不明确。目前关于珍珠对皮肤美白功效的研究还处于起步阶段，本文首次将样品作用于人黑色素细胞模型，研究珍珠水解液抑制黑色素合成的作用机制，为其作为化妆品功效添加剂应用提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 细胞

1.2 供试品珍珠水解液制备

珍珠水解液工艺：珍珠粉 →乳酸化 →酸解珍珠液 →离心分离 →珍珠蛋白→ 酶解珍珠液。将离心分离时得到的酸解珍珠液与酶解珍珠液混合即可得到全成分的水解珍珠液。

1.3 试剂

DMEM培养基(gibco，批号：8115216)，胰蛋白酶-EDTA(gibco，批号：1676922)，双抗混合液(gibco，批号：1697547)，PBS缓冲液(HyClone，批号：NAH1449)，MTT(Sigma)，DMSO(Amresco)，RNA提取试剂盒(Takara)，反转录试剂盒(Takara)，荧光染料(Takara)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：150209)，其他试剂均为国产分析纯。

1.4 仪器耗材

无菌操作台(北京世安科林净化技术有限公司)；CO2培养箱(ThermoScientific)，高速离心机(Eppendof)，倒置显微镜(Olympus)，酶标仪(Tecan)，M3读板仪(Molecular Device)，离心机(Thermo)，荧光定量PCR仪(BioRad)。

2 方法

2.1 细胞培养

采用保护性耕作方式能够改善土壤环境条件，提升土壤中的有机碳和活性有机碳含量，比传统耕作方式更有利于植物生长。通过本次试验研究，可以更好地认识保护性耕作措施对于改善土壤条件和提高有机碳含量的效果，从而推广保护性耕作措施，提高农业生产水平。

选择对数生长期的黑色素细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基传代，置于培养箱37 ℃、5% CO2环境中进行培养。

2.2 人源黑色素细胞细胞活率的测定

采用MTT法测定黑色素细胞活率。收集对数生长期黑色素细胞，以9000 个/孔的密度接种于96孔培养板，培养过夜。分别加入终浓度为0.1% mg·mL-1的熊果苷，终浓度为0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液，以未处理组作为细胞对照组，每组设3个复孔，置于培养箱37 ℃、5% CO2环境中培养48 h，培养结束后，加入MTT，继续孵育4 h后弃掉孔内旧培养基，加入二甲基亚砜溶解结晶，酶标仪490 nm波长下测定各孔吸光度(A)值。

细胞活率=(测定孔A值-空白对照A值)/(细胞对照组A值-空白对照A值)×100%

2.3 黑色素测定

取对数生长期黑色素细胞，以1×105个·mL-1的密度接种于T25细胞培养瓶，每瓶5 mL，培养过夜。分别加入终浓度为0.1% mg·mL-1的熊果苷，终浓度为0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液，以未处理组作为细胞对照组。培养48 h后，弃掉培养基，PBS洗涤1次，加入1M NaOH(10%DMSO)，刮取收集细胞，放入80oC水浴30 min，取上清液加入96孔板，M3读板仪于475 nm读取吸光度值。

黑色素含量变化=(测定孔A值-空白对照A值)/(细胞对照组A值-空白对照A值)

2.4 基因TYR和TRP1及MITF的荧光定量PCR检测

首先以2×105孔的接种密度，接种细胞至6 孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱孵育过夜；待6 孔板中细胞铺板率达到50%左右时，进行给药。实验设立给药组与对照组，每组设3个复孔，实验组加入终浓度为0.25%、0.5%、0.75%的珍珠水解液，对照组加入培养液，37 ℃、5%CO2培养箱分别孵育培养48 h。孵育培养结束后，弃掉培养液，每孔加入1 mL Trizol，吹打裂解细胞后，收样。提取RNA，反转录成cDNA后，进行荧光定量PCR 检测。

本研究中使用的引物的序列如下表所示：

表1 荧光定量PCR的引物序列

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 供试品对人源黑色素细胞细胞活率及黑色素含量的影响

珍珠水解液在0.25%、0.5%、0.75%作用下，对黑色素细胞活率无明显影响，可使黑色素细胞细胞内黑色素含量有所降低，如表2。

实验数据如表2所示，珍珠水解液在0.25%、0.5%、0.75%作用下，对人源黑色素细胞无毒作用；与对照组比较，阳性对照组和样品组均可使黑色素细胞内黑色素含量有所降低，且阳性对照组和0.75%浓度的珍珠水解液的效果差异具有非常显著性意义(P<0.01)。

3.2 荧光定量PCR检测结果

根据荧光定量PCR检测步骤开展检测，检测结果如表3。

实验数据如表2所示，48 h后，与对照组相比，体积分数为0.25%的珍珠水解液对人源黑色素细胞内TYR、TRP1和MITF mRNA的表达均有非常显著性的抑制作用(P<0.01)；体积分数为0.5%、0.75%的珍珠水解液对人源黑色素细胞内TYR和MITF mRNA的表达无明显的影响，但却抑制了TRP1 mRNA的表达，且差异具有非常显著性意义(P<0.01)。

表2 珍珠水解液对于人源黑色素细胞细胞活率及黑色素含量的影响

注：与对照组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

表3 珍珠水解液对人源黑色素细胞中TYR、TRP1和MITF mRNA表达的影响

注：与对照组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

4 讨论

珍珠，含有多种活性成分，自古就是美容养颜之佳品[5]。但目前关于珍珠美白的作用机理尚未有研究报道。本实验建立了人的黑色素细胞模型，通过对黑色素合成相关基因的检测，阐述珍珠水解液的美白作用机理。结果显示，测试浓度下珍珠水解液具有较高的安全性，能够在保持细胞生长的前提下抑制黑色素的生长；同时，在0.25%、0.5%、0.75%测试浓度下，珍珠水解液对黑色素合成关键酶TRP1的基因表达均具有显著抑制作用，在0.25%测试浓度下，珍珠水解液对TYR、TRP1、MITF的基因表达均具有显著的抑制作用。

酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)和转录因子(MITF)均为参与黑色素合成和转运的关键酶。TYR是黑色素合成的关键酶，该酶催化黑色素合成早期限速反应[7]。首先通过羟基化作用将酪氨酸转变为多巴，然后多巴又被该酶氧化为多巴醌，最后在半胱氨酸的参与下，多巴醌被化学修饰为3-半光酰多巴和5-半光酰多巴，正是这两种物质氧化并聚合成褐黑色素。随着反应的进行，半胱氨酸逐步被消耗，多巴醌在酪氨酸酶的作用下形成多巴色素，接着多巴色素失去羧基并通过一系列的氧化和聚合反应形成另一种暗褐色的色素二羟吲哚(DHI)。与此同时，由于多巴色素互变异构酶(DCT)的存在使得部分多巴色素的羟基通过一系列的氧化与聚合反应形成第三种黑色素形式——二羟吲哚羧酸(DHICA)，这种黑色素颜色较浅，呈棕褐色。至此，黑色素合成完全结束。TRP1是第一个克隆成功的色素基因，是黑色素细胞中含量最为丰富的糖蛋白，定位于黑色素小体膜，在黑色素合成过程中发挥重要作用[8]。在动物实验中，TRP1的突变影响鼠棕黑色素的表达，这一过程是通过影响多巴氧化酶和/或DHICA氧化酶来实现的[9]。小眼畸形相关转录因子(MITF)作为黑色素细胞最重要的转录因子，在皮肤黑色素生成过程中，MITF作为分子开关，可调控TRPs家族的表达，参与黑色素的生成[10]。本实验研究结果表明，珍珠水解液可通过抑制黑色素合成中的关键酶尤其是TRP1的基因表达而发挥美白作用。

本实验研究结果为珍珠水解液作为美白的化妆品功效添加剂提供科学依据。

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Skin-whiteningMechanismofMargaritaLiquid

DENG Yunyun1，WANGXiaoyue2，LICaiguang1，MENGhong2，DONGyinmao2，LIli2*

(1.HainanJingrunBiotechnologyCo.Ltd.，Haikou570100，China；2.BeijingTechnologyandBusinessUniversity，Beijing100048，China)

Objective：To study skin-whitening mechanism of Margarita liquid by in vitro melanoma cells tests.Methods：The skin-whitening activities were evaluated by measuring human melanocytes melanin synthesis inhibition activity，and Real-time PCR(RT-PCR)method was further used to evaluate the expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF)，tyrosinase-related protein 1 (TRP1) and Tyrosinase(TYR)mRNA.Results：0.25%，0.5% and 0.75% concentration of Margarita liquid could significantly decreased human melanocytes melanin synthesis，all the three concentrations of Margarita liquid could decrease the expression of TRP1 mRNA，and 0.25% concentration of Margarita liquid could decrease the expression of TYR、TRP1 and MITF mRNA.Conclusion：Margarita liquid was detected to have skin-whitening activity through in vitro Human melanoma cells tests，it could be used as a skin-whitening cosmetic additive.

Margarita liquid；TYR；TRP1；MITF；melanin content；whitening mechanism

] 李丽，副教授，研究方向：化妆品植物功效原料与配方技术；Tel：(010)68987110，E-mail：lili2212@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.017

2016-09-30)

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