牛羊乳α-酪蛋白的B细胞抗原表位预测及免疫反应性分析

薛海燕， 韩 波， 李 珊， 操 歌

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

牛羊乳α-酪蛋白的B细胞抗原表位预测及免疫反应性分析

薛海燕， 韩 波， 李 珊， 操 歌

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

牛羊乳的α-酪蛋白营养功能相似，但蛋白质亚类结构和含量不同，可能是造成其过敏性差异的原因.本文旨在利用生物信息学DNAStar Protean软件、SOPMA以及the BepiPred 1.0服务器对牛羊乳主要过敏蛋白αs1-酪蛋白(Casein，CN)的二级结构、亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性进行预测，分析鉴定主要B细胞抗原表位.合成相应表位肽段序列，制备酪蛋白抗体，采用间接ELISA法分析验证合成多肽的免疫反应性.结果表明：牛羊乳αs1-CN的氨基酸序列同源性89%，但抗原表位存在差异，与牛乳αs1-CN相比，羊乳抗原表位数目相差不大，但两者抗原表位区域存在一定的包含重叠关系.且羊乳αs1-CN合成肽段P-1037(26～31，LSPEVP)、P-1040(140～142，EGN)和牛乳αs1-CN合成肽段P-1038(189～208，TDAPSFSDIPNPIGSENSEK)、P-1039(99～102，EDVP)都具有免疫反应性，该结果为过敏原表位的选择提供基础，为牛羊乳过敏原性比较及改性加工提供理论依据.

牛羊乳；αs1-酪蛋白； 二级结构； 抗原表位

Abstract:Bovine and goat milkα-casein were very similar in the aspect of nutrition and function,but they induced different allergen reaction in consumers because of the differences in protein subclass structure and content.The purpose of this paper was to analyze and identify the B cell epitopes by predicting the secondary structure,hydrophilicity,antigenicity index,surface accessibility and flexibility of major allergic proteinαs1-casein from cow and goat milk using DNAStar Protean software,SOPMA and the BepiPred 1.0 server.Prepared the casein antibody by synthesizing the corresponding epitope peptide sequence and then used an indirect ELISA method to identify the immunoreactivity of the synthetic polypeptide.The results showed that the amino acid sequence homology of cow and goat milkαs1-CN was 89%,but the epitopes were different.The number of epitopes of goat milk was similar compared with cow milkαs1-CN,but there was a certain overlap between the two epitope regions.The peptide fragment P-1037 (26～31,LSPEVP),P-1040 (140～142,EGN) synthesized by the goat milkαs1-CN and the peptide P-1038 (189～208,TDAPSFSDIPNPIGSENSEK),P-1039(99～102,EDVP) synthesized by the cow milkαs1-CN had the immunoreactivity,which provided the basis for the selection of the allergen epitope,and provided the theoretical basis for the comparison of sensitization and modification of cow and goat milk.

Keywords:cow and goat milk;αs1-CN; the secondary structure; epitopes

0 引言

牛乳中富含多种蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质，是人体优质的营养来源，但同时也是联合国粮食及农业组织FAO (1995)报告的八大类过敏食物之一[1].牛乳过敏是指机体对牛乳蛋白的高反应性(hypersensitivity)，是婴幼儿最常见的食物过敏之一，在欧美发达国家，婴儿牛乳过敏症状发生率达0.3%～7.5%[2].目前普遍认为，牛乳蛋白中的酪蛋白(Casein，CN)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-LA)是最主要的过敏原，其中酪蛋白主要由αs1、αS2、β和κ酪蛋白组成，约80%是由αs1-酪蛋白(αs1-CN)组成，对酪蛋白过敏的患者一般都对αs1-CN过敏[3,4].羊乳总热量、干物质、蛋白质、脂肪以及矿物质含量均高于牛乳，具有较高的营养价值，且易被人体消化吸收利用，在国际营养学界被誉为“乳中之王”[5].以羊乳替代牛乳作为婴幼儿主要的营养来源被广泛认可.羊乳和牛乳中酪蛋白所占比例相似，但羊乳中以β和κ-酪蛋白为主，αs1-CN含量(18.9%)远低于牛乳中的含量 (30.8%)[6].羊乳中αs1-CN含量较低，理论上具有较低的致敏性，Hodgkinson等[7]也证实了低αs1-CN含量的山羊乳可以减少抗原摄入量，降低致敏性.然而Muraro等[8]认为山羊乳与牛乳具有相同的致敏性.所以，就目前山羊乳的低致敏性及其在预防婴幼儿牛乳过敏中的应用仍存在争议.

食物蛋白质引起机体致敏的主要原因是消化道内未水解的蛋白质抗原表位被免疫系统识别.抗原表位预测中，B细胞线性表位预测是目前研究的重点，它是研究抗原表位与已知氨基酸序列在蛋白质上的某些结构特征之间的关系，从氨基酸序列的二级结构，亲水性，表面可及性，柔韧性等方面，进行序列的分析预测[6,9].常用的分析软件有ABCpred[10]，BepiPred[11]，SOPMA[12]，DNAStar[13]，其中BepiPred，SOPMA，DNAStar这三种软件较为常用，其基本原理是结合抗原蛋白的结构特点，统计显著性度量，理化性质等指标进行简单预测，操作简单，只需输入蛋白质氨基酸序列，即可得出结果.该研究采用BepiPred，SOPMA和DNAStar这三种预测软件对牛羊乳过敏原αs1-CN B细胞线性抗原表位进行预测分析，并通过实验验证合成的抗原表位是否具有免疫反应性，为进一步对比验证牛乳和羊乳之间的抗原关系提供一定的理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

(1)主要材料：兔抗牛α-CN多克隆抗体(α-CN-IgG，效价1∶204800)，本室制备；HRP-羊抗兔Ig G抗体，北京博奥森生物技术有限公司；碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、明胶等常规试剂均为进口或国产分析纯.

(2)主要仪器：MULTISKANmk3型酶标仪，赛默飞世尔上海仪器有限公司；隔水式电热恒温培养箱，上海岛析实业有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 牛羊乳αs1-CN氨基酸序列

通过NCBI数据库检索牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，该序列在NCBI的基因登录号分别为NP_851372、P18626.

1.2.2 牛羊乳αs1-CN二级结构预测

利用DNAStar Protean软件(Gamier-Robson方法)和SOPMA网络服务器输入检索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列分析预测两者的二级结构.

1.2.3 牛羊乳αs1-CN亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测

应用DNAStar Protean软件，采用Kyte-Doolittle法、Jameson-Wolf法、Emini法和Karplus-Schulz法分别对检索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列进行亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测.

1.2.4 B细胞线性抗原表位确定

利用the BepiPred 1.0服务器，直接输入牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，抗原指数高于1即为可能表位区域[14].并与牛羊乳αs1-CN二级结构预测结果和亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测结果相结合，综合分析得到B细胞线性抗原表位.

1.2.5 牛羊乳αs1-CN多肽合成及鉴定

选择牛羊乳差异较大的抗原表位肽段，由杭州丹港生物科技有限公司，应用全自动多肽合成仪，采用固相合成法从肽链C端向N端依次合成.经反高效液相色谱(RP-HPLC)以及质谱对其进行纯度鉴定，纯度大于98%，符合实验室要求.

1.2.6 多肽免疫反应性鉴定

采用间接ELISA检测合成多肽的免疫反应性.将上述合成的多肽用包被缓冲液稀释至10μg/mL，每孔加入100μL，以α-CN、β-LG蛋白分别作为阳性、阴性对照，4 ℃包被过夜[15].弃去蛋白包被液，每孔加入300μL PBST洗涤液洗涤3次，每次4 min，拍干，除去残留气泡和液体.每孔加入200μL明胶封闭液，37 ℃温箱封闭1.5 h，洗涤，拍干.每孔加入浓度为5μg/mL的α-CN-Ig G 100μL(实验室制备，抗牛乳α-CN多克隆抗体兔血清)，同时设置阴性血清对照，37 ℃温箱温育1.5 h，使抗原抗体充分反应，洗涤拍干.用PBS稀释液将羊抗兔HRP-Ig G以1∶4000的比例稀释作为二抗，每孔加入100μL，37 ℃温箱温育1 h，洗涤，拍干.每孔加入50μL TMB显色液，37 ℃温箱避光显色15 min，显色后每孔加入50μL终止液2 mol/L H2SO4终止反应，450 nm测定吸光值.检测时以P/N值>2.1(即多克隆抗体上清的吸光值大于阴性血清值的2.1倍)判定检测结果为阳性，P/N值<2.1(即多克隆抗体上清的吸光值小于阴性血清值的2.1倍)判定检测结果为阴性[15].

2 结果与分析

2.1 牛羊乳αs1-CN所对应的氨基酸序列

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对比分析牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，将不同差异位点标出，其同源性达到89%，且牛乳αs1-CN氨基酸序列相比羊乳氨基酸差异位点大多为一些极性亲水性氨基酸.

2.2 牛羊乳αs1-CN的二级结构

利用SOPMA网络服务器对牛羊乳αs1-CN二级结构预测，结果如图1所示.

(a)牛乳αs1-CN

(b)羊乳αs1-CN图1 SOPMA预测牛乳αs1-CN 和羊乳αs1-CN二级结构

利用DNAStar Protean软件对牛羊乳αs1-CN二级结构预测，结果如图2所示.

(a)牛乳αs1-CN

(b)羊乳αs1-CN图2 DNAStar预测牛乳αs1-CN 和羊乳αs1-CN二级结构

蛋白质的二级结构是抗原表位预测的重要参数之一.β-转角和无规则卷曲由于其松散的结构，易发生扭曲、盘旋，并展示在蛋白质的表面，因此该区域常含有优势抗原表位而α-螺旋和β-折叠化学键能比较高，结构规则不易变形，较难结合抗体，一般不作为抗原表位[16-18].综合上述两者的预测结果可推出牛乳αs1-CN可能抗原表位区域为19～27，41～43，60～62，99～102，118～120，127～129，148～150，185～186，189～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位区域为18～31，41～42，59～62，78～83，99～103，119～121，128，140～142，172～178，183～186，189～210.对比分析预测出的牛羊乳αs1-CN抗原表位区域，从二级结构预测结果显示羊乳可能抗原区域数目高于牛乳，且它们具有相同抗原区域189～210.

2.3 牛羊乳αs1-CN亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测结果

利用DNAStar Protean软件对αs1-CN(bovine、capra hircus)亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性进行预测，结果如图3所示.

(a)牛乳αs1-CN

(b)羊乳αs1-CN图3 DNAStar预测牛乳αs1-CN和 羊乳αs1-CN亲水性、抗原指数、 表面可及性和柔韧性

蛋白质的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性在抗原形成方面起着主要作用，当亲水性>0、抗原指数>0和表面可及性>1时，形成表位的可能性较大[19-21].综合预测结果推出牛乳αs1-CN可能抗原表位区域为17～19，22～26，50～52，63～67，70～74，77～83，85～105，117～122，129～134，145～149，185～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位区域为17～19，27，30～31，35，48～52，55，62～67，70～76，81～84，90～105，117～119，129～134，139～149，205～219.对比分析两者抗原表位差异得出羊乳αs1-CN抗原表位区域与牛乳相比，其大多分布在αs1-CN氨基酸序列的C端，且羊乳αs1-CN表位区域于牛乳表位区域存在一定的包含重叠关系.

2.4 B细胞线性抗原表位综合预测

蛋白质的二级结构和氨基酸残基的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性都是影响B细胞线性抗原表位的重要因素[22].利用the BepiPred 1.0服务器对牛乳αs1-CN氨基酸序列的抗原指数进行预测得到的可能性抗原表位是21，60～68，80～81,85～86，99～102，142～152，173～179，187～208，羊乳αs1-CN可能性抗原表位是26～31，60～70，74～91，100～102， 140～146，187～208.将the BepiPred 1.0、SOPMA、和DNAStar这三种预测软件得到的抗原表位综合分析得出牛乳αs1-CN可能抗原表位为22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位为18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.对比分析预测得到的牛羊乳αs1-CN抗原表位，较牛乳αs1-CN相比，羊乳αs1-CN同样具有较多区域的抗原表位，且二者存在一定的包含关系.

2.5 牛羊乳αs1-CN合成肽的设计

综合上述可能抗原表位，选择其长度不同的四条预测表位肽段采用固相合成法合成.分别来自于羊乳αs1-CN命名为：P-1037(26～31，LSPEVP)和P-1040(140～142，EGN)；来自于牛乳αs1-CN命名为：P-1038(189～208，TDAPSFSDIPNPIGSENSEK)和P-1039(99～102，EDVP).

2.6 合成肽免疫反应性鉴定

利用实验室制备的兔抗牛α-CN多克隆抗体作为一抗，间接ELISA法检测合成肽的免疫反应性，以P/N>2.1为判断标准，结果如图4示.由图4可知，合成的四种多肽和α-CN均与α-CN-Ig G呈阳性反应，且α-CN测出的吸光值高于合成的四种多肽；而β-LG与α-CN-IgG呈阴性反应，由此初步说明，合成多肽具有免疫反应性.其免疫原性还需进一步验证.

图4 合成多肽免疫反应性鉴定

3 讨论

关于牛乳主要过敏原抗原表位的预测研究报道较多.B Ruite等[23]利用重叠肽的方法发现牛乳αs1-CN的T细胞表位识别位点即43-66，73-96，91-114和127-180.Picariello G等[24]利用体外模拟胃肠消化后的牛乳蛋白水解液通过在Caco-2细胞的转运吸收研究发现β-Lg 40～60和125～135具有一定的致敏性.但目前从抗原位点出发研究羊乳过敏性的报道并不多见，Sanz C L等[25]利用豚鼠进行研究，发现豚鼠经口给予羊奶、牛奶和抗乳血清时，山羊奶的变应原性低于牛奶，其变应原性可能是由酪蛋白和抗乳血清不同蛋白质之间的特异性抗原决定簇引起.本研究对牛羊乳主要过敏原αs1-CN B细胞线性抗原表位进行预测，可为对目前山羊乳的低致敏性及其在预防婴幼儿牛乳过敏中的应用提供一定的理论和技术参考.

蛋白引起致敏的前提是它具有抗原性，而抗原表位是蛋白质具有抗原性的关键因素，是抗原与抗体特异性识别的基本单位.B细胞线性抗原表位是指抗原表面可被B细胞抗体识别的线性片段.所以，准确预测B细胞线性抗原表位，可为单克隆抗体的制备、羊乳抗原性的研究等奠定一定的基础.该研究首先采用SOPMA网络服务器，DNAStar软件对牛羊乳αs1-CN氨基酸序列进行对比分析，得出二者氨基酸序列同源性虽较高，但预测出二级结构仍存在差异，其中羊乳αs1-CN β-转角和无规则卷曲的数量较多，如上述利用SOPMA网络服务器对牛乳αs1-CN二级结构预测得到β-转角和无规则卷曲的数目为3.74%和38.32%，羊乳预测得到的数目为4.21%和44.39%，明显大于牛乳.这些差异同牛羊乳αs1-CN氨基酸序列上个别氨基酸的不同存在一定的关系.其次采用DNAStar软件对牛羊乳αs1-CN的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性预测，由于在肽段1～200位个别氨基酸的不同，预测出的抗原表位在该位存在部分差异且有一定的包含关系，而在200～214肽位间的氨基酸几乎无明显差异，使得此区段预测出的牛乳αs1-CN抗原表位羊乳αs1-CN也同样具有该表位.本研究仅采用了生物学软件对牛羊乳αs1-CN的二级结构，亲水性，抗原指数，表面可及性和柔韧性等预测并通过实验验证了所预测氨基酸序列的免疫反应性，为深入研究羊乳过敏原提供一定的理论依据.

在乳过敏性差异方面，该结果还不能全面的说明羊乳是否可作为低致敏产品代替牛乳作为牛乳过敏患者的直接乳源，还有待对主要过敏原αs2-CN和β-LG等对比分析.但该结果可初步判定羊乳αs1-CN抗原表位合成多肽具有免疫反应性，后续进一步通过动物实验验证其多肽是否具有免疫原性产生抗体.

4 结论

该研究综合三种软件预测参数得到牛乳αs1-CN可能抗原表位为22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位为18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.分析比较牛羊乳αs1-CN B细胞线性抗原表位差异，与牛乳αs1-CN抗原表位相比，羊乳αs1-CN同样具有相当的抗原表位区域.因此，可以初步确定羊乳中虽含有少量的αs1-CN但其仍具有一定的抗原性.通过间接ELISA检测合成多肽的免疫性，实验表明合成多肽呈阳性反应，与抗体发生反应，具有免疫反应性，其免疫原性及过敏原性有待验证.

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【责任编辑：蒋亚儒】

PredictionofBcellantigenepitopesofα-caseincowandgoatmilkanditsimmunoreactivityidentification

XUE Hai-yan, HAN Bo, LI Shan, CAO Ge

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

2017-08-11

国家自然科学基金项目(31301405)； 陕西省科技厅科技统筹创新工程计划项目(2013KTZB02-02-05(2))； 陕西省教育厅专项科研计划项目(16JK1088)

薛海燕(1979-)，女，陕西兴平人，副教授，博士，研究方向：食品营养与安全

2096-398X(2017)05-0133-06

Q518.1

A