独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞表达miRNA—140的影响

陈俊+叶锦霞+林洁+林婧+林秋祥+刘献祥+吴广文

【摘 要】目的：观察独活寄生汤含药血清对体外培养的大鼠退变软骨细胞表达miRNA-140的影响，探讨独活寄生汤防治骨关节炎的作用机制。方法：4周龄SD大鼠膝关节软骨建立体外培养的软骨细胞，采用Ⅱ型胶原原位杂交法对第3代（F3）软骨细胞进行鉴定。用10 ng·mL-1白细胞介素-1β诱导F3软骨细胞，复制退变软骨细胞模型。成功后随机分为模型组和独活寄生汤含药血清组，分别在培养24，48，72 h后采用TaqMan real-time PCR法检测各组miRNA-140表达。结果：独活寄生汤含药血清组

miRNA-140相对表达量随着干预时间的延长逐渐增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：独活寄生汤治疗骨关节炎的部分作用机制是有效促进退变软骨细胞miRNA-140的表达。

【关键词】 骨关节炎；独活寄生汤；含药血清；软骨细胞；miRNA-140

骨关节炎（osteoarthritis，OA）属中医学“痿证”“痹证”“骨痹”范畴，肝肾亏虚致其虚为病之内因，风寒湿邪致其痹为病之外因，故本质为本虚标实、本痿标痹[1]。独活寄生汤出自唐·孙思邈《备急千金要方》，具有扶正祛邪、标本兼顾的特点，能针对OA的病因病机起治疗作用，能有效缓解膝OA的临床症状[2-3]。实验研究发现，独活寄生汤能有效促进软骨细胞增殖[4-5]，抑制软骨细胞凋亡[6]，延缓软骨退变[7]，但其作用机制尚未完全明确。本实验通过观察独活寄生汤含药血清对白细胞介素（IL）-1β诱导的退变软骨细胞表达miRNA-140的影响，进一步探讨独活寄生汤治疗OA的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验药物 独活寄生汤由独活9 g，桑寄生、秦艽、杜仲、防风各6 g等组成，由福建中医药大学附属第二人民医院药剂科提供。使用时用蒸馏水1 L，煎煮2次，每次煎1 h，将2次药液合并，浓缩成1 g·mL-1，保存在-20 ℃冰箱中，备用。

1.2 实验动物 2月龄清洁级雄性SD大鼠24只，体质量（250±10）g；4周龄SD大鼠10只，体质量（100±10）g，均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2012-0002。福建中医药大学实验动物中心具备清洁级医学实验动物环境设施，许可证号：SYXK（闽）2014-0006。

1.3 试剂和仪器 胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）；IL-1β细胞因子（美国Peprotech公司）；DMEM低糖培养基（美国Hyclone公司）；兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体，大鼠IgG二抗，免疫组化试剂盒（北京中杉金桥试剂公司）；提取试剂盒mirVana? miRNA Isolation Kit（美国Thermo Scientific公司）；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific公司）；TaqMan实时荧光定量PCR试剂，探针标记的miRNA-140（引物系列：CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG）、U6（引物系列：AGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTC）及PCR mastermix（美国Invitrogen公司）；ABI 7500实时荧光

定量PCR仪（Applied Biosystems公司）；二氧化碳培养箱（Heraeus公司）；荧光倒置显微镜（徕卡仪器公司）；超净工作台（北京东联哈尔仪器公司）。

2 方 法

2.1 独活寄生汤含药血清的制备 根据随机数字表法将24只2月龄SD大鼠随机分为空白血清组与含药血清组，每组12只。给药剂量参照药理实验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[8]，含药血清组大鼠给予4.65 g·kg-1·d-1独活寄生汤灌胃，早晚各1次；空白血清组大鼠给予每日

2次4.65 mL·kg-1·d-1生理盐水灌胃。连续灌胃7 d，最后一天连续2次灌胃，中间间隔2 h。采血前禁食12 h，2 h后在质量分数为10%水合氯醛麻醉下腹主动脉采血。将所得全血在37 ℃恒温水浴箱中静置30 min后，离心机3000 r·min-1离心15 min，取上清于56 ℃水浴锅中灭活30 min，0.22 μm一次性针头滤器过滤，-20 ℃保存备用。

2.2 软骨细胞的培养 将4周龄SD大鼠，用体积分数为750 mL·L-1的乙醇浸泡后，分离双侧膝关节，带入无菌操作台，取胫骨平台和股骨下端的软骨，剪成1 mm3大小，转移入盛有质量分数为0.2%Ⅱ型胶原酶的培养瓶，37 ℃恒温水浴摇床上消化2 h，取上清液，200目尼龙网筛過滤，离心机1000 r·min-1离心5 min，收集细胞沉淀，用含质量分数为10%的胎牛血清的DMEM低糖培养基（含青霉素、链霉素各100 U·mL-1）重悬细胞，封口放置。原消化瓶中再加入Ⅱ型胶原酶5 mL，重复以上步骤2次，获取细胞悬液。把3次消化所得的软骨细胞悬液混匀，用含质量分数为10%的胎牛血清的DMEM低糖培养基调整细胞浓度为1×105·mL-1，接种于25 cm2培养瓶中，每瓶加5 mL，置于37 ℃、含体积分数为5%的CO2的培养箱中进行培养（F0），待瓶底铺满80%后，进行传代培养，依次标记为第1代软骨细胞（F1），第2代软骨细胞（F2），第3代软骨细胞（F3）。

2.3 退变软骨细胞模型的复制及鉴定 F3软骨细胞以1×105·mL-1的浓度接种于25 cm2培养瓶中，用含10 ng·mL-1 IL-1β无血清基础培养基诱导

24 h复制退变软骨细胞模型[9]。同时运用倒置显微镜观察，免疫组化等方法鉴定退变软骨细胞。免疫组化方法参照SABC免疫组化试剂盒说明书进行，简要步骤如下：取出预先置于25 cm2培养瓶底部的盖玻片，多聚甲醛固定15 min；用质量分数为3%的H2O2孵育10 min；质量分数为0.1%的Triton X-100 PBS液37 ℃孵育30 min；37 ℃血清封闭10 min。一抗37 ℃温育1 h；PBS液清洗5 min，3次；二抗37 ℃孵育30 min。DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片，光镜观察。endprint

2.4 TaqMan real-time PCR检测各组退变软骨细胞miRNA-140表达 将退变软骨细胞随机分为模型组（质量分数为10%的空白血清+ DMEM低糖培养基）和独活寄生汤组（质量分数为10%的独活寄生汤含药血清+ DMEM低糖培养基）。2组细胞分别培养24，48，72 h后，弃培养液，PBS轻柔淋洗1 min，用胰酶消化后离心机1000 r·min-1低速离心5 min，收集细胞。Trizol法提取总RNA，取2 μg RNA逆转录成cDNA，以此为模板行TaqMan real-time PCR扩增miRNA-140及U6。探针标记的miRNA-140和U6均由Applied Biosystems合成。扩增反应条件：50 ℃ 2 min，5 ℃ 10 min；92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。扩增结束后，进行基因表达的差异分析，以U6表达为内参照基因，检测待测样品中目的基因的表达水平，以对照组数据为标准样本，各实验组为待测样品，比较待测样本相对校准样本的表达差异。因实时PCR对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2-ΔΔCt方法可用于计算定量PCR实验基因表达的相对变化，2-ΔΔCt公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中均有介绍，且用2-ΔΔCt方法分析基因表达数据在文献中已有报道[10-11]。故本实验采用2-ΔΔCt法计算miRNA-140基因相对表达量。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用One-Way ANOVA方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 软骨细胞生长过程 刚接种的软骨细胞圆形通亮，悬浮于培养液中，24 h后开始贴壁，36 h后更换培养液，培养至第8天，细胞长满瓶底80%，呈不规则立体“铺路石”样外观（F0）。传代培养后可见F1～F3软骨细胞增殖速度快，形态规则、大小均匀。见图1。

3.2 IL-1β诱导大鼠退变软骨细胞模型鉴定 光镜下可见经过无血清DMEM培养基+ 10 ng·mL-1 IL-1β诱导后的软骨细胞呈多边形改变，可見少量指状突起，体积增大，折光度下降；胞核增大染色变浅，胞膜和胞浆不清晰，细胞增殖速度减慢。Ⅱ型胶原免疫组化结果：用含质量分数为10%的FBS的DMEM培养基培养的正常软骨细胞胞浆染色较深，经过无血清DMEM培养基+ 10 ng·mL-1 IL-1β诱导后的软骨细胞胞浆染色变浅，胞核不染色。见图2。

3.3 独活寄生汤含药血清对退变软骨细胞表达miRNA-140的影响 独活寄生汤组miRNA-140表达量随着干预时间的延长逐渐增加，干预24，48，72 h后分别为1.2651±0.095，1.6324±0.0534，1.9772±0.0146，各时间点间差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

4 讨 论

软骨退变是OA最主要的病理变化，围绕保护关节软骨以防治OA成为治疗的关键。中医学认为，OA属于“痿证”“痹证”范畴，其核心病机为本痿标痹，因此笔者提出以补肾柔肝（治痿）为主，辅以活血祛风（治痹）作为治疗OA的根本大法[12-13]。在独活寄生汤组方中，独活长于祛下焦风寒湿邪，蠲痹止痛，为君药。秦艽、防风祛风胜湿；肉桂温里祛寒，通利血脉；细辛祛寒止痛，均为臣药。佐以桑寄生、杜仲、牛膝、芍药补肾柔肝，强壮筋骨；当归、川芎、干地黄养血活血；人参、茯苓补气健脾。甘草擅治四肢拘挛，缓急止痛，更具调和诸药为使药。诸药合用，共奏补肝肾、益气血、祛风湿、止痹痛之效，能针对OA的病因病机起治疗作用，长期应用于临床，疗效显著[2-3]。

软骨退变作为启动OA病变进程的重要病理变化一直受到研究者的关注。本课题组采用退变软骨细胞作为OA体外研究的细胞模型，在前期实验中，笔者采用Ⅱ型胶原酶消化法获取原代软骨细胞，结果发现刚接种的软骨细胞圆形通亮，悬浮于培养液中，24 h后开始贴壁，36 h后更换培养液，培养至第8天，细胞长满瓶底80%，呈不规则立体“铺路石”样外观。传代培养后可见F1～F3软骨细胞增殖速度快，形态规则、大小均匀。此细胞生长过程与笔者前期实验结果一致[14-15]。IL-lβ在OA发生发展过程中具有重要作用，是最重要的致炎因子之一[16]，其主要通过核转录因子-κB（NF-κB）途径加速软骨基质中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的降解，抑制二者的合成，促进软骨细胞的凋亡[17]，同时还可以诱导基质金属蛋白酶（MMPs）的产生并增强其功能，进一步加速软骨退变进程[18]，引导软骨降解并最终导致OA形成[19]。因此，有学者在体外实验中也运用IL-lβ诱导软骨细胞，成功复制退变软骨细胞模型[20]。结合Sanchez等[21]的既往研究，本研究将10 ng·mL-1作为IL-1β诱导浓度，结果发现诱导后软骨细胞呈多边形改变，边缘可见少量指状突起，体积增大，折光度下降；胞核增大染色变浅，胞膜和胞浆不清晰，细胞增殖速度减慢。

Ⅱ型胶原免疫组化染色也显示IL-1β诱导后软骨细胞胞浆染色变浅，胞核不染色。该鉴定结果与前期研究结果一致[22]，也进一步证实IL-lβ诱导复制退变软骨细胞模型的可行性，也为本实验奠定基础。

miRNA是非编码蛋白的RNA分子，由20～22个核苷酸组成，能够通过对信使RNA的负性调节从而调控人类基因的转录与表达，成熟的miRNA在物种进化过程中相当保守，其转录过程具有严格的时空特异性[23-24]。miRNA-140特异性表达于软骨组织中，随着软骨细胞分化成熟其表达量逐渐增加，是维持软骨组织分化、成熟、形态和功能最重要的miRNA之一[25]。研究表明，miRNA-140高表达可显著抑制IL-1β产生[26-27]。endprint

Miyaki等[26]通过miRNA-140基因敲除小鼠模型的观察，发现基因缺陷小鼠四肢短小、颅面畸形，关节软骨在幼龄即出现蛋白多糖的丢失和细胞外基质的降解从而出现OA样改变。而过表达miRNA-140的小鼠则能够抵抗引起OA的各种因素，预防OA的发生。Karlsen等[28]通过研究体外诱导出miRNA-140高表达的软骨细胞，发现miRNA-140可从多种途径延缓OA的发展：

miRNA-140可降低炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8的表达，减轻OA软骨组织的炎症反应；增加软骨保护性蛋白SOX9、ACAN和CSGALNACT1的水平；下调ADAMTS5引起的软骨细胞外基质的降解，并提高其抑制剂SDC4的水平。进一步验证了miRNA-140在软骨细胞的修复过程中的重要意义（P < 0.05），为关节软骨再生机制提供了一种新的见解，有潜在的治疗意义。

本研究发现，独活寄生汤含药血清组miRNA-140相对表达量随着干预时间的延长逐渐增加，在24，48，72 h分别为1.2651±0.095，.6324±0.0534，1.9772±0.0146，各时间点间差异有统计学意义（P < 0.05），表明独活寄生汤含药血清能增加退变软骨细胞中miRNA-140的表达。由此推测独活寄生汤治疗膝OA的可能分子机制是通过增加

miRNA-140表达，进而降低IL-1β和ADAMTS-5表达，减轻炎症对软骨组织的刺激，对OA起防治作用，具体机制有待于进一步深入研究。

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