斑马鱼在骨相关疾病中的研究进展

黄桂才+黄维琛+郭礼跃+梁江+卢云

【摘 要】 斑马鱼作为目前新兴的研究基因和发育的脊椎动物模型生物模式，具有胚胎透明、骨骼系统发育迅速、与人类相关基因有高度同源性等特点，已经被成功运用于人类相关性疾病研究模型；而斑马鱼与人类骨骼发育相似度高，目前在骨骼发育、骨质疏松模型、骨肿瘤模型、骨关节炎等骨相关疾病方面发展迅速。对斑马鱼生物近年来在骨相关疾病模型方面的研究进展进行文献综述。

【关键词】 斑马鱼；骨骼发育；骨质疏松；骨肿瘤；骨关节炎；综述

斑马鱼最早于20世纪70年代在遗传基因学领域受到科学家的关注，随着关于斑马鱼的相关实验技术在《Nature》等杂志发表，90年代初该模型已成为最重要的模式脊椎动物之一，由于斑马鱼的基因与人类基因相似度高，使得斑马鱼成为受关注的研究人类疾病的模式动物；2012年国家斑马鱼资源中心在中国科学院水生生物研究所正式挂牌成立，国内斑马鱼生物模型研究虽然起步较晚，但发展迅速，截止目前已有250多个实验室参与斑马鱼相关研究。随着研究深入，发现该模型在骨骼系统较传统鼠兔模型具有成本低、周期短等优势，尤其是在骨质疏松、骨关节炎、骨肿瘤等骨相关疾病及治疗药物通量筛选方面发展迅速，本文就斑马鱼模型在骨相关疾病中的研究应用概况进行综述。

1 斑马鱼的特点和优势

1.1 斑马鱼简介及特点 斑马鱼是一种原产印度的热带淡水鱼，属脊椎动物亚门辐鳍鱼纲鲤科，由于其体侧有银蓝色的纵向条纹而得名，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼。斑马鱼体型纤细呈纺锤形，成体长3～4 cm，对水质要求不高，孵出后约4个月达到性成熟，成熟鱼每隔几日可产1次卵。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求25～31 ℃。孵出水溫24 ℃时，受精卵经2～3 d孵出仔鱼；水温28 ℃时，受精卵经36 h孵出仔鱼，雌鱼每次产卵200～300枚，易于实验室养殖和研究。

1.2 斑马鱼在骨相关疾病研究的优势 斑马鱼在骨相关疾病研究方面具备如下优势。①与人类基因、骨骼发育相似度高。Howe等[1]通过对斑马鱼基因序列组合与人类基因比较，发现其与人类基因相似度达到87%，即约70%的人类基因至少有一个明显的斑马鱼直系同源物；斑马鱼能够直接从间充质细胞和软骨前体育出骨骼[2-3]，在解剖学上类似于哺乳动物骨骼，提供了一种有用的骨骼研究动物模型。②斑马鱼繁殖快、耗时短、成本低、生物安全性好[4]，不易传染疾病。通过对比斑马鱼与鼠、兔等哺乳动物在治疗骨相关疾病的药物毒性发育中研究发现，斑马鱼较鼠、兔具有测试成本低、速度快等优点[5]，证明脊椎动物斑马鱼已成为高通量药物筛选的易处理模型生物。③胚胎发育迅速、易于观察。由于斑马鱼能够体外受精和发育，胚胎透明，且胚胎发育过程清晰可见[6]，斑马鱼颅面骨骼的骨化开始于受精后3 d，受精约120 h后斑马鱼各组织、脏器、骨骼均已发育完全，在显微镜下可直接观察其胚胎发育情况，在第8天可使用茜素红染色通过目视检查在标准解剖显微镜上分析胚胎，拾取不显示软骨缺陷的特异性骨突变体，具有耗时短，对骨骼发育畸形易于观察的优势。④可塑性强。研究发现斑马鱼骨模型较鼠、猴骨模型在基因转录与敲除等方面可塑性强[7]，应被视为越来越有价值的骨模型。总而言之，斑马鱼骨模型相对传统的鼠、兔、猴动物模型具有繁殖快、成本低、耗时短、效率高、灵敏度高等优势，被广泛运用于胚胎发育、遗传与基因学、药物筛选、人类疾病模型的研究，目前已有神经系统、血液系统、肿瘤及骨相关疾病系统等人类疾病模型建立，因该生物的骨骼系统发育迅速，被众多研究者称为研究脊椎动物发育的理想模式，是药物毒性测试研究的顶级模式[8]。

2 斑马鱼模型在骨相关疾病中的研究

2.1 骨发育方面研究 人类骨骼发育是由间充质干细胞发生[9]，从胚胎早期间充质干细胞骨原基起始。目前，骨的发生方式主要有膜内成骨和软骨成骨两种方式，由于斑马鱼与人类骨骼发育相似度高，故在骨发育基因遗传疾病、骨生长信号通路、成骨不全、脊柱侧弯等方面均有研究。Sawada等[10]通过使用斑马鱼模型，发现短的同源基因（SHOX）通过延迟骨矿化前胚胎生长及早期胚胎损失来影响前椎骨和颅骨骨骼的骨形成，并在全身早期胚胎生长中起重要作用，推测出SHOX基因的体内成骨作用在人与斑马鱼两者的进化相似。此外有研究通过使用wehTp85c作为研究铁缺乏的骨代谢模型，发现wehTp85c突变幼鱼表现出骨形成缺陷，同样得出斑马鱼模型可用于骨骼发育的基因研究[11]。由于斑马鱼的基因序列组合在许多方面与人类相似，骨骼和矿化组织也不例外，故在与人类疾病同源的骨矿化障碍中，斑马鱼模型可以对遗传性骨骼疾病调查的小鼠和组织培养系统形成补充[12]。此外，该幼鱼的光学透明度允许体内成骨细胞和破骨细胞的可视化，能够测试化合物对破骨细胞的影响，表明在鱼类中可以比在小鼠中更快速和更经济地实现化合物；斑马鱼由于遗传资源发育良好，对脊柱曲率具有天然易感性，已成为研究特发性脊柱侧凸（IS）的强大系统，被运用于IS的遗传和生物学模型的效用研究中[13-14]，有望进一步投入预防严重的脊柱侧凸疾病的基础研究中。目前，斑马鱼模型在骨发育方面的研究应用优势逐渐显现，但由于斑马鱼在骨发育方面属于新兴领域且研究数量较有限，仍需足够的样本量及实验室研究论证。

2.2 骨质疏松方面研究 斑马鱼的骨骼具有与人类骨骼相似的性质，这表明它们可以用作研究人类哈弗斯（Haversian）系统的矿化特征以及人类骨骼疾病的模型，并具有研究脊椎动物骨骼正常和病理发育以及矿化的潜在机制的适用性和优势[15]，尤其在糖皮质激素诱导的骨质疏松模型研究方面发展迅速，对于糖皮质激素性骨质疏松症（GIOP）的发病机制主要有影响钙稳定，抑制骨形成，影响性激素等，其中Rankl/OPG通道在发病机制中影响较大。To等[16]研究发现，在激素诱导的骨质疏松模型中由Rankl的过度表达诱导的骨质疏松症，并通过体内成像方法证实了Rankl在硬骨鱼中的破骨细胞发生中的保守作用。通过运用地塞米松使斑马鱼头骨骼矿化量和骨密度显著降低，成功诱导斑马鱼产生骨质疏松，建立起糖皮质激素诱导骨质疏松模型，解决了GIOP的传统动物造模既缓慢又昂贵的问题[17-18]。黄觅等[19]将淫羊藿苷单体混合物对泼尼松龙诱导的GIOP斑马鱼模型进行干预，采用茜素红染色对斑马鱼幼鱼头骨发育积分评价发现，淫羊藿苷能有效促进斑马鱼颅骨矿化和防止泼尼松龙诱导的骨质疏松症，类似的研究同样表明中药丹参酮能影响成骨细胞特异性基因和活性氧（ROS）的表达[20]，从而起到抗GIOP的作用。总而言之，斑马鱼模型具有评价周期短、成本低、药物筛选活性高等特点，在中药药物活性筛选、中药抗GIOP疗效评估等方面具有传统动物模型不可替代的优势，尤其是为抗GIOP传统中药经验方体内活性批量筛选方面提供了新的可能，值得研究推广。endprint

2.3 骨肿瘤方面研究 基于斑马鱼与人类癌症之间高度的遗传相似性，提出了斑马鱼作为允许调查多种候选基因缺陷的快速模型系统[21-22]，并可作为骨相关癌症研究的综合模式，被运用于骨肉瘤、骨髓瘤、脊索瘤等方面，鉴于研究肿瘤方式的多样化，斑马鱼胚胎还可运用于新药物递送器和免疫系统调节剂的组合来筛选药物方案。Mohseny等[23]通过用斑马鱼胚胎在体内外建立多个骨肉瘤模型，证实该生物具有研究的实用性和新颖性。Roccaro等[24]通过观察斑马鱼衍生的CD41-HSCs归巢到与MM细胞相同的区域，表明斑马鱼可用于研究造血细胞的人类骨髓瘤细胞的归巢模型。而 Burger等[25]通过建立脊索瘤的斑马鱼模型发现，mTORC1抑制剂雷帕霉素可延迟斑马鱼模型中的肿瘤发生并提高存活率，从而推测RASV12驱动的斑马鱼模型可以使潜在的治疗剂高通量筛选并有助于治疗该病；综上可见，斑马鱼模型在骨肿瘤方面的优势已逐渐显现，值得临床进一步深入研究。

2.4 骨关节炎（osteoarthritis，OA）方面研究 斑马鱼在OA模型方面研究在国内尚属新兴领域，国外已有报道。由于OA软骨发生的某些变化概括了软骨内骨化的发展过程，而斑马鱼是经过遗传研究和发育生物学验证的模型[26]，越来越多的证据表明OA具有很强的遗传成分，该模型在OA中的运用或将有助于阐明该病的发病机制。Mitchell等[27]发现斑马鱼幼鱼中六种OA易感基因的表达模式，并在不同的成熟阶段产生了兩条标记软骨细胞的新转基因品系，继而明确了该模型在OA中发挥作用的基因效用，进一步证实该模型的基因高通量筛优势。相似的研究通过分析OA斑马鱼模型之间的年龄，并评估其胸鳍关节以发现OA的迹象，通过番红染色，发现较老的斑马鱼始终显现OA的常见症状（包括骨骼软骨、软骨钙化、软骨细胞增殖、蛋白聚糖染色增加等），得出类似于曼金评分的得分方法评估斑马鱼OA的严重程度，证实该模型的胸鳍、肩鳍可用于肩胛关节OA的研究[28]。此外，还发现该模型表达出几种OA新的生物标志物（Tgf-β1，Mmp13，Ddr2和Htra-1）[29]。由此笔者推测，该模型可作为研究OA的模型生物体，并将有助于该模型的技术推广，通过斑马鱼OA模型的建立和推广或将有助于治疗OA的药物研究或前瞻性的遗传筛选，为临床治疗该病提供指导。以上研究皆表明，可以利用斑马鱼作为一种人类骨关节病理学研究的动物模型，并证实斑马鱼可作为研究人类病因复杂骨疾病的理想模型。

2.5 其他骨相关疾病方面研究 斑马鱼还运用于佩吉特氏骨病等骨相关骨疾病的研究。Silva等[30]通过斑马鱼模型研究SQSTM1基因在佩吉特氏骨病（PDB）和骨骼发育中的生物学起重要作用。此外，斑马鱼还用于骨再生[31]、布鲁克综合征（BS）[32]、脊髓性肌萎缩（SMA）[33]等方面的研究。

3 小结与展望

综上所述，斑马鱼模型在骨相关疾病研究中具有优势：①与人类基因、骨骼具有高相似度，胚胎透明且发育迅速；②与传统鼠、兔哺乳动物相比具有繁殖快、周期短、成本低、生物安全性高、药物筛选高通量等无可比拟的优势。但斑马鱼模型依然存在一定局限性：①由于斑马鱼为非哺乳动物，该模型在脏器（心、肝、肾）的病理改变与哺乳动物存在较大差别、与人类个别基因落点还存在差异，仍需在哺乳动物模型或人体实验室验证；②斑马鱼体型较小，缺少滑膜关节组织，部分疾病模型标本取材有限，导致检验标准差异性大，不便于分析。总之，因斑马鱼骨骼与人类相似的性质，使得该模型在骨相关疾病的研究中运用越发广泛，目前以骨质疏松模型、OA、骨肿瘤模型及药物的毒效评估方面较为成熟，特别是在抗GIOP斑马鱼模型中药的发育毒性、药物活性筛选、疗效评估等方面发展迅速，有望替代传统鼠、兔模型进行初期的药物筛选，并为传统中药及民族经验方药运用于骨质疏松临床诊疗中提供有力的实验室依据。但目前国内在该领域世纪产品开发不足，各大公司不能供给日益增长的实验室研究模型需求，因此未来可在骨质疏松、OA等斑马鱼模型等方面深入研究，为临床治疗该类骨相关疾病提供实验室依据，并由此推测斑马鱼在未来的科研市场具有巨大的

潜力。

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