福建省浙江红花油茶遗传多样性的ISSR分析

宋倩倩 ，付茂旺 ，何艺凡 ，林文俊 ，陈 辉 *，郑国华 ，李 煜

（1.福建农林大学林学院；2.福建省油茶工程技术研究中心，福州 350002）

福建省浙江红花油茶遗传多样性的ISSR分析

宋倩倩1，2，付茂旺1，2，何艺凡1，2，林文俊1，2，陈 辉1，2*，郑国华1，2，李 煜1，2

（1.福建农林大学林学院；2.福建省油茶工程技术研究中心，福州 350002）

【目的】为福建省浙江红花油茶的良种选育与充分开发利用提供参考。【方法】以福建省13个居群198份浙江红花油茶为实验材料，对其进行遗传多样性的ISSR分子标记分析。【结果】17个ISSR引物扩增出167条位点，其中多态性位点142条，平均多态位点百分率为85.03%。13个居群浙江红花油茶的遗传距离的变化范围为0.1459～0.5094。通过遗传距离进行聚类分析，可将13个天然居群的浙江红花油茶分为4个大类。【结论】福建省不同地区的浙江红花油茶遗传多样性丰富，居群间亲缘关系差异明显。

浙江红花油茶；ISSR；遗传多样性；聚类分析

浙江红花油茶（Camellia chekiangoleosa Hu），又名浙江红山茶，是山茶科（Theaceae）红山茶属的常绿小乔木[1-2]。浙江红花油茶含油率比普通油茶高出5%～10%，且油质优于普通油茶，是我国特有的木本油料树种[3-4]。浙江红花油茶是集庭院观赏和食用双重功能于一体的树种，具有重要的经济价值，主要产于浙江、福建（北部）、江西（东部及中部）、湖南（南部）、安徽（南部），能够在海拔600～1200 m的山区正常开花结果[1，5]。

分子标记技术是直接在DNA水平上反映出种间或种内核苷酸序列多样性的一种遗传标记，具有数量多，多态性高、结果稳定且重复性好等特点[6]。许多分析标记技术已被用来检测植物的遗传变异型性[7]。ISSR技术作为分子标记技术的一种，也被广泛的应用于植物种间和种内的遗传多样性分析[8-9]。相关研究表明，ISSR分子标记技术可以有效地研究物种基因多态性[10]。且已在油茶的遗传多样性与亲缘关系研究方面得到广泛的应用[11-12]。ISSR分子标志技术在油茶种质资源的研究中的广泛应用，为快速准确地鉴定油茶品种提供了理论基础与技术平台。

目前，浙江红花油茶多处于野生或半野生的栽培状态。但是，福建省是浙江红花油茶的主要天然分布区之一，对于该地区浙江红花油茶的遗传多样性研究尚未见报道。本文以福建省不同地理区域浙江红花油茶为材料，利用ISSR分子标记技术研究福建省不同居群的浙江红花油茶的遗传多样性，以期为浙江红花油茶的保护以及分子辅助良种选育提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为福建省13个居群198份浙江红花油茶。样株信息见表1。

表1 13个天然居群浙江红花油茶信息Table 1 Information of 13 natural population of Camellia chekiangoleosa Hu

1.2 方法

1.2.1 ISSR－PCR扩增反应体系的建立

采用改进的CTAB法提取基因组DNA，通过正交实验方法对ISSR-PCR扩增反应进行优化，建立浙江红花油茶的ISSR-PCR反应体系与扩增程序。优化后反应体系如下：DNA（1.5 ng/μL)20μL，Taq酶（0.8 U/μL)1μL，引物（800μmol/L)1μL，dNTP（1.25mmol/L)1μL，Mg2+（1.0mmol/L)1μL。优化后扩增程序如下：94℃预变性5min；40个循环为94℃变性30 s，退火温度因引物而定，时间50 s，72℃延伸1.5min，最后72℃延伸8min，4℃保存。

1.2.2 数据分析

基于QuantityOne的图像分析与人工计带相结合的方式对ISSR分子标记的数据进行统计与分析，统计扩增总位点数、多态性比率。根据Nei's（1978）的遗传距离，进行聚类分析，生成亲缘关系图谱。

2 结果与分析

2.1 多态性分析

从进行扩增的90个浙江红花油茶样品中筛选出17个多态性丰富、重复性好的ISSR引物进行基因组DNA多态性检测。共扩增出重复性好的位点167条，其中多态性位点142条，多态性比率达85.03%。17条ISSR引物产生的多态性位点详见表2、图1。

2.2 聚类分析

本文根据Nei（1978）的遗传距离公式，计算13个居群间遗传距离，见表3。并利用居群间的遗传距离，对13个居群的浙江红花油茶做UPGMA聚类分析，得出亲缘关系图谱，如图2所示。13个居群浙江红花油茶的遗传距离在0.1459～0.5094之间。根据聚类图，可将13个天然居群的浙江红花油茶聚为4大类：第Ⅰ大类为XP、PCⅡ、PCⅢ；第Ⅱ大类为ZRⅢ、GT；第Ⅲ大类为 ZRⅠ、ZRⅡ、MH、SNⅡ；第Ⅳ大类为 SNⅠ、TN 、JL、PCⅠ。

3 讨论与结论

17个ISSR引物共扩增出167个位点。扩增的167个位点中有25个为供试材料所共有，占总位点比例的14.97%，表明在种水平上13个天然居群的浙江红花油茶具有稳定性。扩增位点最多的是引物14，位点数为 14；扩增位点最少的是引物 3、5、10、15，均为8个位点。引物9、13的多态位点百分率最高，均为100%；引物12的多态位点百分率最低，仅为66.67%。

根据遗传距离来进行的聚类分析具有权威性和科学性[13]。杜明凤等[14]应用ISSR分子标记技术对13个种源的马尾松开展遗传多样性研究，结果表明群体间的遗传距离与地理距离之间存在显著相关

性，遗传变异主要分布于群体内，群体间已出现了明显的遗传分化。周兰英[15]等运用ISSR技术对98个油茶种质资源进行遗传多样性分析，结果表明地域距离越远，居群间遗传距离越大，地理隔离是构成油茶遗传多样性的重要基础。谢荟[16]对黎蒴与广宁红花油茶进行遗传多样性SRAP分析，根据遗传距离进行的聚类分析能够将不同地理距离区分开。

表2 17条ISSR-PCR引物扩增结果Table 2 The result of amplifying by 17 primers

图1 引物ISSR-45扩增图谱Figure 1 Map of bands amplified by ISSR-45

表3 浙江红花油茶13个天然居群间的遗传距离Table 3 Genetic distance among 13 geographic populations

图2 基于居群间遗传距离的聚类分析Figure 2 The gathers analysis based on result of and genetic distance

ISSR分子标志技术已广泛地应用于油茶种质资源的研究。谢云等[17]运用ISSR分子标记技术对7个浙江红花油茶居群的210个个体进行遗传多样性分析，筛选出21条引物，共扩增出384个位点，其中多态性位点372个，结果表明居群间的遗传分化低于居群内部，居群间的地理距离与遗传一致度存在一定相关性。刘杨等[18]运用ISSR分子标记技术对55份油茶资源进行遗传多样性研究，筛选出13条引物，共扩增出110个位点，其中多态性位点107个，结果表明不同油茶资源遗传多样性较高，其中海南种源的油茶亲缘性较高，但仍有地区差异性。彭继庆[19]等利用ISSR分子标记技术对博白大果油茶进行遗传多样性研究，结果表明博白大果油茶种水平具有较高的遗传多样性，种群的变异主要来自种群内部，种群间分化程度较低。

本研究从198份90个浙江红花油茶样品中筛选17个具有重复性和多态性好的引物，对福建省13个居群的浙江红花油茶进行ISSR分子标记分析，结果表明各地区之间的差异明显，说明浙江红花油茶种源间亲缘关系差异较大、多态性丰富。根据聚类分析，居群间的遗传距离与实际地理距离关系不显著，但部分同一地区的居群聚为一类表明其在地理分布上的一致性，故不能仅根据居群的实际地理距离判定浙江红花油茶的亲缘关系。已有研究表明，浙江红花油茶天然居群间的亲缘关系受基因遗传与地理环境的共同作用[20]，所以对于浙江红花油茶居群间的遗传距离与实际地理距离之间的关系研究还有待深入。该实验结果为研究福建省浙江红花油茶的居群间的亲缘关系提供了参考，也为福建省浙江红花油茶的良种选育与种质资源的开发与利用提供了材料依据。

［1］庄瑞林.中国油茶［M］.北京：中国林业出版社，2012：71-72.

［2］祈承经，汤庚国.树木学（第二版）［M］.中国林业出版社，2010：304-305.

［3］杨军，邱日红，赵文进，等.浙江红花油茶种质资源及开发利用［J］.现代园艺，2012（9）：12-13.

［4］何方，胡芳名.经济林栽培学（第二版）［M］.中国林业出版社，2010：279-280.

［5］刘曲，高焕章，姚小华，等.低海拔地区浙江红花油茶无性系树体性状变异研究［J］.湖北农业科学，2015，54（5）：1105-1108.

［6］蹇黎.分子标记在药用兰科植物研究中的应用［J］.种子，2015，34（2）：51-53.

［7］靳晓丽，田新会，杜文华.基于ISSR分子标记的鹰嘴豆遗传多样性分析［J］.中国草地学报，2015，37（3）：19-25.

［8］赵谦，杜虹，庄东红.ISSR分子标记及其在植物研究中的应用［J］.2007，5（f11）：123-129.

［9］HAMZA H，BENABDERRAHIM M A，ELBEKKAY M，et al.Investigation of genetic variation in Tunisian date palm（Phoenix dactylifera L.）cultivars using ISSR marker systems and their relationwithfruitcharacteristic［sJ］.TurkishJournalofBiology，2012，18（3）：196-198.

［10］QI S S，FAN Y，GONG Z N，et al.Genetic diversity of Shiraia bambusicola from East China assessed using ISSR makers［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2015（59）：239-245.

［11］周兰英，王湘南，陈永忠，等.油茶种质遗传多样性的分子标记技术与EST 文库构建［J］.生命科学研究，2012，16（6）：557-565.

［12］董斌，李荣喜，黄永芳，等.分子标记在油茶研究中的应用［J］.生物技术通报2015，31（6）：74-80.

［13］SUN L，ZHENG Y ，Yuan，et al.Genetic diversity of Atractylodes macrocephala by ISSR［J］.China journal of Chinese materia edica，2013，37（22）：3381-3385.

［14］杜明凤，丁贵杰.不同种源马尾松ISSR遗传结构及影响因素分析［J］.广西植物，2016，36（9）：1068-1075.

［15］周兰英.油茶种质资源多样性的ISSR分析［D］.湖南师范大学，2014，

［16］谢荟.黎蒴与广宁红花油茶种质资源遗传多样性研究［D］.华南农业大学，2016.

［17］谢云，李纪元，范正琪，等.浙江红山茶总DNA提取及ISSR-PCR引物筛选［J］.安徽农业科学，2011，39（25）：15210-15212.

［18］刘扬，彭赟，贺瑞，等.基于ISSR标记的海南油茶种质资源遗传多样性分析［J］.分子植物育种，2016（2）：517-523.

［19］彭继庆，曹福祥，范海燕.博白大果油茶遗传多样性的ISSR研究［J］.中南林业科技大学学报，2013，33（7）：62-66.

［20］刘子雷，姚小华，杨水平，等.浙江红花油茶果实经济性状变异的研究［J］.西南大学学报（自然科学版），2007，29（4）：83-88.

ISSR Analysis of Genetic Diversity of Camellia chekiangoleosa Hu in Fujian Province

SONG Qian-qian1，2，FU Mao-wang1，2，HE Yi-fan1，2，LIN Wen-jun1，2，CHEN Hui1，2*，ZHENG Guo-hua1，2，LI Yu1，2
（1.College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University；2.Camellia Engineering Technology Research Center，Fuzhou 350002，China）

【Objective】The objective of this study was to provide a reference for fully exploiting and utilizing the germplasm resources of Camellia chekiangoleosa Hu in Fujian province.【Method】The genetic diversity of 13 populations of C.chekiangoleosa in Fujian Province was analyzed by ISSR molecular marker technique.【Results】The results showed that 17 primers were obtained and 167 loci were amplified;in addition，polymorphic loci was 142 and the average percentage of polymorphic loci was 85.03%.The genetic distance of 13 populations of C.chekiangoleosa in Fujian province ranged from 0.7451 to 0.9402.The 13 populations of C.chekiangoleosa in Fujian province were divided into four groups by cluster analysis based on genetic distance.【Conclusion】The genetic diversity of C.chekiangoleosa in different areas of Fujian Province was rich and the genetic relationship among populations was significant.

Camellia chekiangoleosa Hu；ISSR；Genetic Diversity；Cluster analysis

S664.2

A

1000-2650（2017）03-0370-05

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.03.013

2017-03-06

福建省科技重大专项(2013NZ0001-1)；福建省科技厅平台建设项目(2010N2001）；高等学校博士学科点专项科研基金(20123515110010)共同资助。

宋倩倩，硕士研究生。*责任作者：陈辉，教授、博士、博士生导师，主要研究经济林培育。E-mail：zjchchenh@163.com。

（本文审稿：陈盛相；责任编辑：巩艳红；英文编辑：徐振锋）