IL-6基因单核苷酸多态性与中国汉族人群乙型肝炎易感性的相关性研究

朱秀云 汪文斐 吴伟刚 李红春 刘威龙 张明霞 刘磊

518112 深圳市第三人民医院 广东省新发传染病诊治重点实验室(朱秀云、汪文斐、吴伟刚、李红春、刘威龙、张明霞、刘磊)

IL-6基因单核苷酸多态性与中国汉族人群乙型肝炎易感性的相关性研究

朱秀云 汪文斐 吴伟刚 李红春 刘威龙 张明霞 刘磊

518112 深圳市第三人民医院 广东省新发传染病诊治重点实验室(朱秀云、汪文斐、吴伟刚、李红春、刘威龙、张明霞、刘磊)

目的白细胞介素-6(IL-6)在慢性病毒性肝炎发病机制和相关的肝脏疾病中有重要的作用，本文拟通过大样本病例-对照研究以及临床数据分析探讨IL-6单核苷酸多态性与HBV感染易感性的相关性，从而达到能够通过检测机体IL-6基因的表达的水平来预防和治疗HBV感染的目的。方法选取深圳地区汉族HBV病患者共计848例，对照组894例，抽提基因组DNA，运用TaqMan探针的技术对上述标本的rs1 800 796位点进行基因分型。结果rs1 800 796位点的单核苷酸多态性与HBV感染的易感性相关P=0.0003，OR=1.43，两者之间的差异具有统计学意义。结论IL-6rs1 800 796位点的单核苷酸多态性与汉族人群HBV感染的易感性相关。

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒(Hepatitis B virus HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病[1-2]。近年来的研究表明宿主基因多态性与乙肝的易感性显著相关[3-4]。乙肝易感基因的筛选和确定，不仅是预测诊断发生乙肝高危人群和制定相应预防决策的依据，同时也是乙肝靶向基因和药物治疗的基础。白细胞介素6(IL-6)是一种重要的多肽类细胞因子，具有参与调节免疫应答、参与炎症反应等多种功能[5-6]。

本研究利用TaqMan探针技术对IL-6基因启动子区域翻译起始位点上游-572位点rs1 800 796位点进行基因分型，通过实验组HBV、HCV和HIV患者与健康对照组IL-6rs1 800 796位点的基因型分布分析，发现IL-6中的rs1 800 796位点与HBV的易感性相关。然后进一步扩大样本通过实验组与健康对照组的比较，来证实rs1 800 796位点与HBV的相关性。最后通过比较健康对照组与实验组HBV患者血浆及细胞中IL-6基因表达的水平，进一步证实IL-6基因ra1 800 796位点单核苷酸多态性与HBV感染易感性的相关性。

1 对象与方法

1.1研究对象本研究所用血液标本均取自深圳市第三人民医院。根据统计学的样本数估算，我们以符合统计学要求的样本数量进行基因多态性分析，拟入组HBV患者和健康对照两个组别，选取了深圳地区汉族HBV病患者共计848例，所有病例均根据病史、临床表现确诊为HBV；对照组为健康体检和义务献血者894例，无HBV,HCV,HIV病史。人血液样本200 μl 提取全基因组DNA，通过紫外分光光度计测定DNA浓度均≥50 ng/μl，NanodropDNA测定仪测定DNA纯度(OD260/280)。所有研究对象均签署知情同意书，经深圳市第三人民医院伦理委员会审查通过。

表1 实验组IL-6rs1 800 796位点多态性与HBV,HCV,HIV易感性之间的关系

1.2研究方法

1.2.1 样本收集:用肝素锂抗凝管收集研究对象静脉血2～3 ml，200 μl全血用于提取全基因组DNA，通过紫外分光光度计测定DNA浓度均≥50 ng/μl，NanodropDNA测定仪测定DNA纯度(OD260/280)。

1.2.2 实验材料:(1)全血DNA抽提试剂盒 QIAamp DNA Blood Mini kit购自德国Qiagen 公司；(2)TaqMan 探针基因分型试剂盒购自美国ABI公司。

1.2.3 方法:(1)提取全血中人基因组的DNA 严格按照Qiagen全血DNA抽提试剂盒说明书操作提取基因组DNA。(2)利用TaqMan探针进行基因分型。PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，读取扩增后信号后，ABI7500PCR仪将扩增前的本底信号去除，通过仪器检测荧光值的变化，便可得到相应SNP位点的分型结果。(3) PBMC的分离、培养、及刺激6～8 ml全血用密度梯度离心的方法分离PBMC，将PBMC铺到24孔细胞培养板中，对照组加入终浓度为10 mg/L的HBV核心抗原，刺激72 h后收集细胞提取RNA，细胞培养上清进行ELSIA检测。

2 结果

2.1基因组DNA纯度鉴定提取人血液样本2 ml提取全基因组DNA，通过紫外分光光度计测定DNA浓度均≥50 ng/μl，NanodropDNA测定仪测定DNA纯度(OD260/280)在1.80～2.00之间随机选取稀释的12份DNA标本工作液进行琼脂糖凝胶电泳，结果提示基因组DNA完整性良好。

2.2rs1800796位点的多态性与HBV,HCV,HIV疾病易感性的相关性分析为了分析rs1 800 796位点的多态性与病毒感染的易感性之间的关系，我们运用TaqMan探针的技术对HBV，HCV，HIV患者组和健康组rs1 800 796位点进行基因分型，结果显示rs1 800 796位点的单核苷酸多态性与HBV感染的易感性相关P=0.0003，OR=1.43，两者之间的差异具有统计学意义。与HCV和HIV感染组的差异无统计学意义(表1)。同时在HBV患者组和健康对照组rs1 800 796位点中基因型CC，CG，GG的分布具有显著的差异，在HBV患者中基因型CC的的比例明显高于基因型(CG+GG)P=0-0004，OR=1.53，差异具有统计学意义。提示rs1 800 796位点的等位基因C与增加HBV感染的风险。

表2 验证组IL-6rs1 800 796位点多态性与HBV易感性之间的关系

表3 以性别和年龄分层分析rs1 800 796位点基因分布的差异

2.3IL-6基因rs1800796位点的多态性与HBV易感性的验证基因多态性需要大样本估算，故针对此单一位点rs1800796我们采用了基于TaqMan 探针技术的Real-time PCR基因分型，扩大样本(病例组848人，对照组894人)进行验证。rs1 800 796位点基因型在此人群中仍具有哈迪温伯格平衡。在验证人群中，乙肝患者C等位基因频率为81.1%，健康对照为75.0%，两组之间差异具有统计学意义(P=0.0003，OR=1.43，95%CI=1.21～1.68)(表2)。进一步证实了在汉族人群中IL-6基因rs1 800 796位点等位基因C与HBV易感性增加的风险显著相关。

2.4以年龄和性别分层研究rs1800796多态性与HBV易感性的关系根据性别分层研究，我们发现一个有趣的现象，与健康对照组男女比例相比，实验人群和验证人群中的HBV患者中男性居多(表3)，最近的研究发现在男性HBV患者中rs1 800 796位点的G等位基因高于健康人群，提示我们rs1800796G等位基因可能是HBV感染的一个保护基因，但是却是肝癌的一个危险标记。

2.5在血浆和细胞水平研究rs1800796基因多态性对IL-6分泌的影响为了研究rs1 800 796位点的多态性对IL-6基因表达的影响，我们检测了健康组和HBV组人群血浆中IL-6的水平，发现HBV感染的患者中rs1800796GG基因型血浆中的IL-6含量低于rs1800796CC基因型，但是俩者之间的差异不具有统计学意义(图1 A)。PBMC在HBV核心抗原的刺激下，IL-6基因表达的水平在CC基因型明显高于GG基因型，差异具有统计学意义。(图1B)。

图1 基因型对IL6基因表达的影响. A 不同基因型的HBV患者和健康对照(HC)中血浆中IL6水平. B 不同基因型的纯化的CD14+细胞中IL6水平Fig.1 Influence of SNP rs1800796 on IL6 gene production. A Plasma IL-6 levels in controls and chronic hepatitis B cases with different rs1800796 genotype. B IL-6 production by purified CD14+ monocytes with different rs1800796 genotypes

3 讨论

随着基因组流行病学的发展，乙肝候选易感基因也逐渐被确认，分析研究这些基因在乙肝发生发展中的作用已经成为当前该领域一个重要的研究方向[7]。彭等的研究发现HIV/AIDS患者体内Th17及Th1应答失衡可能与IL6的表达失调相关[8]。屈等的研究也发现，慢性乙型肝炎患者经IFNα治疗过程中NK细胞也发挥了重要的作用[9]。

在非汉族人群中IL-6基因的其他SNP位点与活动性结核的相关性也有报道，与加拿大土著居民比较发现，其rs1800795 G位点具有较高的等位基因频率，提示其可能与结核的易感性相关。但是在印度和哥伦比亚居民中结果却不相同[10]。产生这些差异的根本原因目前还不是很清楚，或许是某些技术原因抑或是样本的数目太少，进一步可能的解释是每个研究中种族的构成不同。在汉族人群中，rs1 800 796位点的单核苷酸多态性与上述的假设一致，在一些研究中发现，此位点的多态性与其他一些炎症疾病的易感性相关，包括Ⅱ型糖尿病，特发性膜性肾病，冠心病和慢性牙周炎[11]。相比之下，其他族裔中rs1800795和rs1 800 797位点存在显著变异，但是这两个已经确定的位点的变异在汉族人群中并不常见。这表明rs1 800 796位点在汉族人群中是包括分枝杆菌感染在内的炎症性疾病易感性的遗传变异的基础。

本研究利用TaqMan探针技术对IL-6基因启动子区域翻译起始位点上游-572位点rs1 800 796位点进行基因分型，通过实验组HBV、HCV和HIV患者与健康对照组IL-6rs1 800 796位点的基因型分布分析，发现IL-6中的rs1 800 796位点与HBV的易感性相关。然后进一步扩大样本通过实验组与健康对照组的比较，来证实rs1 800 796位点与HBV的相关性。最后通过比较健康对照组与实验组HBV患者血浆及细胞中IL-6基因表达的水平，进一步证实IL-6基因rs1 800 796位点的单核苷酸多态性影响了IL-6基因的表达水平。

综上所述，IL-6基因rs1800796单核苷酸多态性可能与汉族人群乙肝的易感性有关，rs1800796G等位基因可能为HBV感染的一个保护基因；因此其多态性检测科作为一种遗传标记进行检测，对早期发现乙肝易感人群以及对乙肝防治工作具有重要意义。本研究深入地揭示宿主IL6基因遗传易感性在乙型肝炎中发生发展中的作用，为乙型肝炎易感人群的预防干预决策及结核病基因型特异性个体化治疗提供理论依据。IL-6基因的转录调控是由基因序列的多个位点相互作用进行调控的，因涉及人种差异，需要在不同国家，不同种族进行大样本的研究，以进一步揭示该基因多态性与结核易感性的关系。

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2017-05-17)

(本文编辑：陈培莉)

AssociationofsinglenucleotidepolymorphismofIL-6genewithsusceptibilitytohepatitisBvirus

ZhuXiuyun,WangWenfei,WuWeigang,LiHongchun,LiuWeilong,ZhangMingxia,LiuLei

ThirdPeople’sHospitalofShenzhen,GuangdongKeyLaboratoryforDiagnosis&TreatmentofEmergingInfectiousDiseases.Shenzhen(518112)China

ObjectiveLeukocyte mediated IL-6 (IL-6) plays an important role in chronic viral hepatitis pathogenesis and related liver diseases, We did a large sample-size case-control study and clinical data analysis to find association between IL-6 single nucleotide polymorphism and HBV susceptibility, and to achieve the detection of the body on the expression of IL-6 for the prevention and treatment of HBV infection.MethodsTotally 848 HBV patients and 894 healthy controls in Shenzhen were selected and rs1800796 genotypes were determined by TaqMan assays.ResultsThe result showed that rs1800796 polymorphism was associated with susceptibility to HBV infection (P=0.0003, odds ratio (OR)=1.43, the difference was statistically significant.ConclusionsThe single nucleotide polymorphism of IL-6rs1800796 locus was associated with the susceptibility of HBV infection in Chinese population, and the rs1800796 G allele is a protective gene for HBV infection.

Single nucleotide polymorphism；Interleukin-6；Hepatitis B virus

刘磊，Email:liulei3322@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.004

单核苷酸多态性；白细胞介素6；肝炎病毒,乙型

广东省自然科学基金(2015A030313692); 深圳市肝胆疾病研究重点实验室项目(ZDSYS201504301534057)；深圳市科技计划项目(JCYJ20160427183548637，JCYJ20160427152106244)；深圳市卫生计生系统科研项目(201501029)

FundprogramsGuangdong Natural Science Foundation(2015A030313692)Shenzhen Key Laboratory of Hepatobiliary Diseases(ZDSYS201504301534057)；Shenzhen Science and Technology Plan Project(JCYJ20160427183548637，JCYJ20160427152106244)；Shenzhen Health and Family Planning Program(201501029)