典型磺胺类抗生素对油菜叶片叶绿素、可溶性蛋白及抗氧化酶的影响*

李亚宁 张丽红 殷艳艳张 晨 刘 刚 李凤祥

(1.南开大学滨海学院环境科学与工程系，天津 300270；2.南开大学化学学院，天津 300071；3.天津市环境监测中心，天津 300191；4.南开大学环境科学与工程学院，天津 300071)

典型磺胺类抗生素对油菜叶片叶绿素、可溶性蛋白及抗氧化酶的影响*

李亚宁1,2张丽红3殷艳艳1#张 晨1刘 刚1李凤祥4

(1.南开大学滨海学院环境科学与工程系，天津 300270；2.南开大学化学学院，天津 300071；3.天津市环境监测中心，天津 300191；4.南开大学环境科学与工程学院，天津 300071)

通过盆栽实验研究了典型磺胺类抗生素磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺甲基嘧啶(SM1)和磺胺噻唑(ST)对油菜叶片内抗氧化酶(POD)活性、叶绿素(CHL)含量和可溶性蛋白(SP)含量的影响。结果表明：在低浓度染毒处理(15.0 mg/kg)和高浓度染毒处理(45.0 mg/kg)下， SM1、ST对油菜叶片中的CHL含量均有显著抑制作用(P<0.05)，SMZ对油菜叶片中的CHL含量有极显著抑制作用(P<0.01)。3种磺胺类抗生素对油菜叶片SP含量的抑制作用随着染毒浓度的增加逐渐增强，其中SMZ对SP含量的抑制作用最大。两种浓度的染毒处理下，3种磺胺类抗生素对油菜叶片的POD活性均产生极显著诱导(P<0.01)作用，并且SMZ对POD活性的诱导作用最为显著。综上，SMZ、SM1和ST均显著影响了油菜体内的生化过程，并且3种抗生素中SMZ的毒性效应最强。

磺胺类抗生素 油菜 叶绿素 可溶性蛋白 抗氧化酶

磺胺类抗生素是以氨苯磺胺为母体合成的一类化学药物，一直被广泛用于人体和禽畜的疾病预防与治疗[1-2]。据统计，磺胺类抗生素在世界各国的抗生素销售及使用量中均居于首位[3]。西班牙的一项研究表明，污水处理厂污泥中磺胺甲基嘧啶(SM1)的质量浓度高达139 mg/kg，磺胺噻唑(ST)的质量浓度高达77 mg/kg[4]32。同时，磺胺类抗生素在动物粪肥中也广泛存在，据HÖLZEL等[5]报道，液态猪粪中14种磺胺类抗生素的质量浓度达0.05～38.40 mg/kg。含有磺胺类抗生素的动物粪肥及污泥堆肥施入土壤中，势必会引起土壤环境的污染。GARCA GALN等[4]34的研究表明，SM1、磺胺硝苯以及磺胺甲氧吡哒嗪在土壤中的质量浓度分别高达20.4、17.1、15.6 μg/kg。李彦文等[6]检测了广州、深圳等地菜地土壤中的6种磺胺类抗生素，其平均质量浓度为4.90～51.40 μg/kg。而关于土壤环境中磺胺类抗生素污染引起的植物生态毒性研究也受到越来越多的关注。金彩霞等[7]研究了磺胺间甲氧嘧啶(SMM)对小麦和西红柿的毒性效应，结果显示SMM对两种植物的根伸长和芽生长均具有较强的抑制作用。肖明月等[8]发现当磺胺二甲嘧啶染毒质量浓度大于8.00 mg/L时，其对小白菜种子的萌发会产生显著的抑制作用。然而关于磺胺类抗生素对植物毒性机理的研究还并不多见，因此有必要在此方面开展更多的研究工作。

陆生高等植物是陆生生态系统的生产者，其生长情况可反映整个生态系统的健康状况，为此研究污染胁迫对陆生植物的生态毒性具有重要意义。为此，本研究以较为常用的磺胺类抗生素磺胺甲恶唑(SMZ)、SM1及ST为研究对象，并以具代表性的陆生高等植物油菜(Brassicacampestris)作为生态毒理学模式生物，通过盆栽实验研究3种磺胺类抗生素胁迫对油菜幼苗叶片中的叶绿素(CHL)和可溶性蛋白(SP)含量以及抗氧化酶(POD)活性的影响，以期为磺胺类抗生素的生态风险评价和安全管理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

TU-1901双光束紫外可见分光光度计，Hettich 32R低温高速冷冻离心机(德国Hettich公司)。SMZ、SM1、ST纯度均为98%，购自Sigma公司，其他试剂均为分析纯或化学纯级别。

1.2 土壤样品制备

采集表层(0～20 cm)未污染土壤，风干后过2.0 mm筛后备用。该土壤有机质质量浓度为18.9 g/kg，阳离子交换量为163 mmol/kg，pH为8.78。先将一小部分干净土壤与抗生素混合，拌匀后再将染毒土壤与干净土壤进行不断搅拌，以保证充分混匀，使土壤样品中各抗生素的最终质量浓度分别为15.0、45.0 mg/kg。

1.3 植物培养

挑选籽粒饱满的油菜种子，放入恒温培养箱中，于25 ℃下培养5 d，将油菜幼苗分别种植在不同浓度梯度的染毒土壤中盆栽培养，同时设置干净土壤为空白对照组(CK)。本实验共设置6个处理组，每个处理组3次重复。第1、2、3处理组为低浓度染毒组，土壤中分别为15.0 mg/kg的ST、SMZ、SM1，第4、5、6处理组为高浓度染毒组，土壤中分别为45.0 mg/kg的ST、SMZ、SM1，每天给植物浇水，培养1个月后采样测定植物幼苗叶片中CHL、SP含量及POD活性。

1.4 测定方法

CHL的测定参照文献[9]；SP的测定参照文献[10]；POD活性的测定采用愈创木酚法[11]。

1.5 统计分析

实验结果均以平均数±标准偏差表示，采用SPSS统计软件对组间数据进行差异显著性分析，P<0.05表明差异显著，P<0.01表明差异极显著，P>0.05表明差异不显著。

2 结果与讨论

2.1 磺胺类抗生素对CHL的影响

由图1可见，与CK组相比，3种磺胺类抗生素染毒处理1个月后，油菜叶片中的CHL含量均被显著抑制(P<0.05)。其中，第2、5处理组CHL最低，说明SMZ胁迫对CHL的抑制作用最大，经低浓度、高浓度SMZ染毒处理后，油菜叶片中的CHL均极显著(P<0.01)低于CK组。此外，第1、4处理组，第2、5处理组，第3、6处理组之间的CHL含量差别不大，说明抗生素染毒浓度的增加，油菜叶片CHL含量的变化并不明显，表明油菜叶片CHL含量与磺胺类抗生素染毒浓度之间无显著的剂量—效应关系。

注：**表示与CK组比较差异极显著(P<0.01),*表示与CK组比较差异显著(P<0.05)，图2、图3同。

图1磺胺类抗生素对油菜叶片CHL的影响
Fig.1 Effects of sulfonamides on CHL inBrassicacampestrisleaves

植物叶片中的CHL会直接参与植物的光合作用，其含量可反映植物体生长及受胁迫的状况[12]。由于CHL的敏感性，当植物体暴露于重金属或有机污染物时，CHL会受到影响，进而影响植物体。ZHANG等[13]在研究石油烃对海洋微藻的生态毒性时发现，青岛大扁藻、球等鞭金藻以及小新月菱形藻体内的CHL含量均受到不同程度的抑制。本研究也得到相似结论，在15.0、45.0 mg/kg两种染毒水平下，磺胺类抗生素染毒组对油菜叶片中的CHL均有显著抑制作用，尤其是SMZ对叶绿素的抑制作用明显高于SM1和ST。可能是磺胺类抗生素对CHL合成过程中的关键酶类(如叶绿素酸酯还原酶等)具有抑制作用，进而影响了CHL的合成[14]。

2.2 磺胺类抗生素对SP的影响

由图2可见，3种磺胺类抗生素的低浓度染毒处理组对油菜叶片中的SP含量影响相差较大，第3组油菜叶片中的SP含量与CK组差异不显著，第1组油菜叶片中的SP含量与CK组差异显著，第2组油菜叶片中的SP含量与CK组差异极显著，低浓度SMZ对油菜叶片SP的抑制作用最大。经3种磺胺类抗生素的高浓度染毒处理后，SP含量进一步降低，也表现为SMZ对油菜叶片SP的抑制作用最大，而高浓度ST与SM1对SP含量的抑制作用差异不大。

图2 磺胺类抗生素对油菜叶片SP的影响Fig.2 Effects of sulfonamides on SP in Brassica campestris leaves

SP作为标志植物体内总体代谢的重要指标，往往对污染物的长期胁迫更敏感[15]。本研究中，当染毒质量浓度为15.0 mg/kg时，3种磺胺类抗生素对油菜叶片中SP的合成已开始产生一定的抑制作用；随着染毒质量浓度增加到45.0 mg/kg，抑制作用更加明显。这可能是由于抗生素的胁迫使油菜叶片中R基因的激活受到抑制，进而使SP的合成受到抑制，或是由于高浓度抗生素胁迫使合成的SP分解[16]。

2.3 磺胺类抗生素对POD活性的影响

由图3可见，在两种浓度的染毒处理下，3种磺胺类抗生素对油菜叶片POD活性均有极显著的诱导作用。尤其是SMZ胁迫下，POD的活性均显著增加，3种抗生素的诱导作用强度为SMZ>SM1>ST。

抗氧化防御系统主要用于清除活性氧自由基(ROS)，因此在生物体抵御胁迫及保护细胞免受ROS造成的伤害中起到重要作用。在抗氧化防御系统中的众多酶类里，POD因其在细胞内外都可清除ROS，而成为最主要的抗氧化防御酶[17]。张军等[18]研究发现，单一溶解性有机质或双酚A暴露都会诱导POD活性产生。本研究中，无论是低浓度染毒处理组还是高浓度染毒处理组，3种磺胺类抗生素对油菜叶片中的POD活性均有极显著的诱导作用，说明在抗生素胁迫下油菜体内产生了大量的ROS，而油菜启动了自身的抗氧化防御能力，利用POD清除这些ROS，POD活性就被诱导，这是植物体进行自我保护的体现。但有研究表明，低浓度的四氯乙烯会诱导小麦幼苗中的POD活性，而高浓度的四氯乙烯则会抑制POD活性[19]，表明植物体的抗氧化防御能力是有限的，当污染物浓度过高而产生过多的ROS时，就超出了POD的清除能力，POD活性即被抑制。可见，实验物种、抗生素种类及染毒剂量都会对POD活性产生不同影响。

图3 磺胺类抗生素对油菜叶片POD活性的影响Fig.3 Effects of sulfonamides on the activity of POD in Brassia campestris leaves

3 结 论

在低浓度染毒处理和高浓度染毒处理下，SM1、ST对油菜叶片中的CHL含量均有显著抑制作用(P<0.05)，SMZ对油菜叶片中的CHL含量有极显著抑制作用(P<0.01)。3种磺胺类抗生素对油菜叶片SP含量的抑制作用随着染毒浓度的增加逐渐增强，其中SMZ对SP含量的抑制作用最大。两种浓度的染毒处理下，3种磺胺类抗生素对油菜叶片的POD活性均产生极显著诱导(P<0.01)，并且SMZ对POD活性的诱导作用最为显著。综上，SMZ、SM1和ST均显著影响了油菜体内的生化过程，并且3种抗生素中SMZ的毒性效应最强。

[1] BOXALL A B A,BLACKWELL P,CAVALLO R,et al.The sorption and transport of a sulphonamide antibiotic in soil systems[J].Toxicology Letters,2002,131(1/2):19-28.

[2] GILMAN A G,RALL T W,NIES A S,et al.Goodman and gilman’s pharmacological basis of therapeutics[M].8th ed.New York:Pergamon Press,1990.

[3] WITTE W.Medical consequences of antibiotic use in agriculture[J].Science,1998,279(5353):996-997.

[5] HÖLZEL C S,HARMS K S,KÜCHENHOFF H,et al.Phenotypic and genotypic bacterial antimicrobial resistance in liquid pig manure is variously associated with contents of tetracyclines and sulfonamides[J].Journal of Applied Microbiology,2010,108(5):1642-1656.

[6] 李彦文,莫测辉,赵娜,等.菜地土壤中磺胺类和四环素类抗生素污染特征研究[J].环境科学,2009,30(6):1762-1766.

[7] 金彩霞,刘军军,鲍林林,等.磺胺间甲氧嘧啶-镉复合污染对作物种子发芽的影响[J].中国环境科学,2010,30(6):839-844.

[8] 肖明月,安婧,纪占华,等.6种常见抗生素对小白菜种子萌发及生理特性的影响[J].生态学杂志,2014,33(10):2775-2781.

[9] HEGEDÜS A,ERDEI S,HORVATH G.Comparative studies of H2O2detoxifying enzymes in green and greening barley seedling under cadmium stress[J].Plant Science,2001,160(6):1085-1093.

[10] BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72(1/2):248-254.

[11] WU X Y,VON TIEDEMANN A.Impact of fungicides on active oxygen species and antioxidant enzymes in spring barley (HordeumvulgareL.) exposed to ozone[J].Environmental Pollution,2002,116(1):37-47.

[12] WANG C,ZHANG S,WANG P F,et al.Salicylic acid involved in the regulation of nutrient elements uptake and oxidative stress inVallisnerianatans(Lour.) Hara under Pb stress[J].Chemosphere,2011,84(1):136-142.

[13] ZHANG Y,TANG X X.Effect of oil water-accommodated fraction on growth and chlorophyll-a of marine microalgae[J].Advanced Materials Research,2013,726:94-97.

[14] KÜPPER H,KÜPPER F,SPILLER M.Environmental relevance of heavy metal-substituted chlorophylls using the example of water plants[J].Experimental Botanical,1996,47(2):259-266.

[15] 潘林,张艳馥,金忠民.Zn2+、Cr6+胁迫对水螅的急性毒理作用及对可溶性蛋白的影响[J].河南农业科学,2013,42(9):120-123.

[16] LI Y N,ZHOU Q X,LI F X,et al.Effects of tetrabromobisphenol A as an emerging pollutant on wheat (Triticumaestivum) at biochemical levels[J].Chemosphere,2008,74(1):119-124.

[17] 杜秀敏,殷文璇.植物中活性氧的产生及清除机制[J].生物工程学报,2001,17(2):121-125.

[18] 张军,葛碧洲,侯瑞,等.再生水中溶解性有机质和双酚A对浮水植物的复合胁迫效应[J].环境污染与防治,2015,37(9):1-4.

[19] 杨秀婧,单爱琴,揣小明,等.四氯乙烯污染对小麦幼苗抗氧化酶系的影响[J].环境污染与防治,2008,30(6):17-19.

Effectsoftypicalsulfonamidesonthechlorophyll，solubleproteincontentsandperoxidasesactivityofBrassicacampestris

LIYaning1,2,ZHANGLihong3,YINYanyan1,ZHANGChen1,LIUGang1,LIFengxiang4.

(1.LaboratoryofEnvironmentalScienceandEngineering,BinhaiCollegeofNankaiUniversity,Tianjin300270;2.CollegeofChemistry,NankaiUniversity,Tianjin300071;3.TianjinEnvironmentalMonitoringCenter,Tianjin300191;4.CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NankaiUniversity,Tianjin300071)

The effects of 3 typical sulfonamides (SAs) of sulfamethoxazole (SMZ),sulfamerazine (SM1),and sulfathiazole (ST) on the peroxides (POD) activity,the contents of chlorophyll (CHL) and soluble protein (SP) ofBrassicacampestriswere investigated by pot experiments. The results indicated that under both low-dose (15.0 mg/kg) and high-dose (45.0 mg/kg) exposure conditions,SM1 and ST treatments significantly (P<0.05) decreased the CHL content inBrassicacampestris,and SMZ treatment highly significantly (P<0.01) decreased the CHL content inBrassicacampestris. The inhibition of the three kinds of SAs on the SP content was increased with the increase of concentrations of SAs. The inhibition of SMZ on the SP content was the most significant. Under the two dose exposure conditions,all the treatments of the three kinds of SAs highly significantly (P<0.01) increased the POD activity. Also,the induction of SMZ on the POD activity was the most significant. Therefore,SMZ,SM1,and ST significantly influenced the biochemical process ofBrassicacampestris. And,the toxicity of SMZ was higher than SM1 and ST.

sulfonamides;Brassicacampestris; chlorophyll; soluble protein; peroxidases

李亚宁，女，1981年生，博士，副教授，研究方向为环境分析化学与污染生态化学。#

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*国家自然科学基金青年科学基金资助项目(No.41503109、No.21601094)；国家自然科学基金面上资助项目(No.31570504)；天津市自然科学基金资助项目(No.16JCYBJC22900)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.11.010

2017-07-10)