维拉帕米及艾灸对长春新碱耐药胃癌细胞株SGC7901逆转增效作用

王 楠，宋小骏，蒋 凤，谢学建

维拉帕米及艾灸对长春新碱耐药胃癌细胞株SGC7901逆转增效作用

王 楠，宋小骏，蒋 凤，谢学建

目的观察维拉帕米(VPM)及艾灸对小鼠长春新碱(VCR)耐药SGC7901胃癌移植后的瘤体重量、抑瘤率及P-糖蛋白(P-gp)表达的影响，以了解两者对长春新碱耐药逆转增效作用。方法分别进行不同剂量维拉帕米及艾灸联合不同剂量维拉帕米抗肿瘤耐药的实验。第一组实验将SD小鼠分成等渗盐水组、VCR对照组、VPM对照组、0.5 mg/kg VPM+VCR组、1.0 mg/kg VPM+VCR组、1.5 mg/kg VPM+VCR组、2.0 mg/kg VPM+VCR组，，每组16只，雌雄各半，所有模型组小鼠在左前肢腋下接种瘤组织，按组给予等渗盐水和不同剂量药物，15 d后，取出瘤体称重，计算抑瘤率，同时留取瘤体标本，检测多药耐药(MDR)相关蛋白P-gp的变化。第二组实验将SD小鼠分成等渗盐水组、VCR对照组、VPM对照组、艾灸对照组、0.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸组、1.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸组、1.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸组、2.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸组，每组16只，雌雄各半，所有模型组小鼠在左前肢腋下接种瘤组织，按组给予等渗盐水和不同剂量药物及艾灸，15 d后，取出瘤体称重，计算抑瘤率，同时留取瘤体标本，检测MDR相关蛋白P-gp的变化。结果第一组实验中给予维拉帕米时，等渗盐水组与不同剂量药物组间差异有统计学意义(Plt;0.05)，随剂量增加瘤体重量下降、抑瘤率增加和蛋白P-gp表达下降，但1.5 mg/kg和2.0 mg/kg时，蛋白P-gp值差异无统计学意义。第二组实验中给予维拉帕米和艾灸时，等渗盐水组与不同剂量药物组间差异也有统计学意义(Plt;0.05)，随剂量增加瘤体重量下降、抑瘤率增加和蛋白P-gp表达下降，其中剂量组:1.5 mg/kg和2.0 mg/kg与仅给予维拉帕米组相比差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论维拉帕米和艾灸对小鼠长春新碱耐药SGC7901胃癌耐药具有逆转增效作用，在2.0 mg/kg维拉帕米、0.5 mg/kg长春新碱、艾灸联合用药时可达到单用1.0 mg/kg长春新碱用药效果。

维拉帕米；艾灸；SGC7901胃癌；长春新碱；耐药；逆转增效

近年来针对恶性肿瘤的新化疗药物不断出现，化疗方案不断改进，但普遍存在肿瘤多药耐药(multi-drug resistance，MDR)，一直是治疗失败的主要原因，也是化疗治疗肿瘤以来一直悬而未决的重要问题。因此，克服肿瘤细胞多药耐药及增强化疗药物的效果，将关系到恶性肿瘤患者化疗的疗效及预后。

维拉帕米(verapamil，VPM)为钙通道阻滞剂(钙拮抗剂)，对肿瘤细胞MDR表型的具有逆转作用[1]。 Bellamy等[2]进一步作了有关的实验，单用维拉帕米即能逆转耐药细胞对阿霉素的拮抗作用,能增加细胞内阿霉素的积聚，细胞内药物浓度的增加是通过细胞对药物外排的减少而实现的。基础研究表明维拉帕米不仅可以与化疗药物竞争细胞膜上 P-170的结合位点，而且可在 MDR1 基因的转录水平上抑制 P-170 的表达，增加肿瘤细胞内化疗药物的浓度，从而逆转其耐药性[3-5]。

艾灸在临床报道中能逆转肿瘤耐药，并能对抗肿瘤药物起到增效减毒作用，在动物实验中也取得了进展，为临床上提供了治疗恶性肿瘤患者的一种重要的辅助治疗方法，但艾灸疗法在恶性肿瘤治疗中的应用尚处于初期阶段，无论是在临床研究还是实验研究过程中仍然存在一定的问题，尤其在临床研究中还需进一步规范试验设计，运用循证医学理论合理评价艾灸治疗恶性肿瘤的疗效[6-8]；在动物实验研究中还需进一步深入探讨治疗肿瘤的作用机制，发挥艾灸疗法在恶性肿瘤治疗中的治疗作用[9-11]。

本研究以长春新碱(vincristin，VCR)诱导的SGC7901耐药细胞为研究对象,研究维拉帕米及艾灸对该耐药细胞移植后瘤体重量、抑瘤率及P-糖蛋白(P-gp)表达的影响，为维拉帕米及艾灸的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 小牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程材料研究所; 青霉素、链霉素为国产哈尔滨制药总厂; 四甲基偶氮唑盐(MTT)购自北方同正生物制品公司; 长春新碱及维拉帕米均为国产，长春新碱为广东岭南制药有限公司，维拉帕米注射剂为上海禾丰制药有限公司。鼠抗人P-糖蛋白荧光抗体由晶美生物工程有限公司提供。

1.2仪器和设备 二氧化碳培养箱: HF151UV 上海力申科学仪器有限公司; 超净工作台: BHC-1000II A/B3苏州安泰空气技术公司; 倒置显微镜:CKX41F奥林巴斯; 酶标仪: BHP9504 北京滨松光子技术有限公司;流式细胞仪:美天旎MACSQuant。

1.3 方法

1.3.1耐药细胞株 胃癌细胞株SGC-7901/VCR购自上海复祥生物科技有限公司(采用胃癌SGC-7901细胞株，模拟临床用药特点，应用高浓度反复间歇诱导的方法，建立胃癌细胞株SGC-7901对长春新碱多药耐药细胞系 SGC-7901/VCR)。将所购SGC-7901/VCR细胞在培养液中稳定传代 2 周后，取处于指数生长期的细胞，常规胰蛋白酶消化制备单细胞悬液备用。

1.3.2动物模型制作 取指数生长期SGC-7901/VCR细胞，在SD小鼠左前肢腋下皮下注射SGC-7901/VCR细胞2×106/0.2 mL，获得实体瘤，选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，置于等渗盐水中切成约1 mm×1 mm×1 mm小块，备用。取SD小鼠在其左前肢腋下接种瘤组织，同时分组给予等渗盐水和不同剂量药物及艾灸。等渗盐水组腹腔注射等渗盐水0.1 mL，每日1次，连续15 d。VCR对照组腹腔注射长春新碱1.0 mg/kg，每日1次，连续15 d (与维拉帕米及艾灸联合应用时长春新碱的剂量为0.5 mg/kg)。VPM对照组腹腔注射维拉帕米1.0 mg/kg，每日1次，连续15 d。艾灸组造模开始后，于接种次日开始施治，施灸局部剃毛露出皮肤，使用艾绒制成半米粒大艾炷，放置于穴位相对部位，用线香点燃，连续施治15 d。中脘穴灸每日1壮，足三里穴则左右穴位每日交替灸各1壮。

1.3.3不同剂量维拉帕米抗肿瘤耐药性的研究 采用上述小鼠模型，随机分为等渗盐水组、VCR对照组、VPM对照组、0.5 mg/kg VPM+VCR组、1.0 mg/kg VPM+VCR组、1.5 mg/kg VPM+VCR组、2.0 mg/kg VPM+VCR组，每组16只，雌雄各半。每天观察负瘤小鼠的活动状况、毛色及食欲情况，每周测量体重。每周测量瘤体体积，15 d后颈椎脱臼处死小鼠，取出瘤体称重，计算抑瘤率，同时留取瘤体标本，置于液氮中，检测MDR相关蛋白(P-gp)的变化。

1.3.4艾灸联合不同剂量维拉帕米抗肿瘤耐药的研究 采用上述小鼠模型，随机分为等渗盐水组、VCR对照组、VPM对照组、艾灸对照组、0.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸组、1.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸组、1.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸组、2.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸组，每组16只，雌雄各半。每天观察负瘤小鼠的活动状况、毛色及食欲情况，每周测量体重。每周测量瘤体体积，15 d后颈椎脱臼处死小鼠，取出瘤体称重，计算抑瘤率，同时留取瘤体标本，置于液氮中，检测MDR相关蛋白P-gp的变化。

1.4瘤重及抑瘤率的计算 打开左前肢腋下,剥离肿瘤,称重,并计算抑瘤率。

抑瘤率=[(等渗盐水组的平均瘤重-药物组的平均瘤重)/等渗盐水组的平均瘤重]×100%

1.5流式细胞仪检测P-糖蛋白表达 选取剥离后瘤块,切成小块，用胰酶消化，PBS洗涤 2 次，加入200 μL PBS重悬细胞，取100 μL细胞悬液加入鼠抗人P-gp-PE (1∶50) 20 μL，阴性对照另取100 μL悬 液 加 入 鼠 抗 人-Ig G2b-PE 20 μL，混匀后静置于4 ℃，避光30 min，用 PBS 洗涤去未结合单抗，400 μL PBS 重悬细胞，上机检测。

2 结 果

2.1不同剂量维拉帕米抗肿瘤耐药性的瘤体重量、抑瘤率及P-gp值 瘤体重量:对照组、药物组与等渗盐水组间差异有统计学意义(Plt;0.05)；VCR对照组与0.5、1.0和1.5 mg/kg VPM+VCR组间差异有统计学意义(Plt;0.05)，但与2.0 mg/kg VPM+VCR组间差异无统计学意义(Pgt;0.05)；VPM对照组与1.0、1.5和2.0 mg/kg VPM+VCR组间差异有统计学意义(Plt;0.05)。抑瘤率：随着VPM的剂量增加，VPM+VCR联合治疗的抑瘤率接近于VCR对照组的抑瘤率。P-gp值:对照组、药物组与等渗盐水组间差异有统计学意义(Plt;0.05)；0.5 mg/kg VPM+VCR组与1.0 mg/kg VPM+VCR组间差异有统计学意义(Plt;0.05)。见表1。

2.2艾灸联合不同剂量维拉帕米抗肿瘤耐药的瘤体重量、抑瘤率及P-gp值 瘤体重量：对照组、药物组与等渗盐水组间差异有统计学意义(Plt;0.05)；VCR对照组与0.5、1.0和1.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸组间差异有统计学意义(Plt;0.05)，但与2.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸组间差异无统计学意义(Pgt;0.05)；VPM对照组、艾灸对照组与1.0、1.5和2.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸组间差异有统计学意义(Plt;0.05)。抑瘤率：随着VPM的剂量增加，VPM+VCR+艾灸联合治疗的抑瘤率接近于VCR对照组的抑瘤率。P-gp值：对照组、药物组与等渗盐水组间差异有统计学意义(Plt;0.05)；0.5 mg/kg VPM+VCR+艾灸组与1.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸组间差异有统计学意义(Plt;0.05)。1.5、2.0 mg/kg VPM+VCR+艾灸组的P-gp值分别与对应与未增加艾灸治疗的1.5、2.0 mg/kg VPM+VCR组的P-gp值差异有统计学意义(Plt;0.05)。见表2。

表1不同剂量维拉帕米和长春新碱治疗后的瘤体重量、抑瘤率及P-gp值比较

组别n瘤体重量(g)抑瘤率(%)P⁃gp值等渗盐水组161 493±0 048-0 890±0 064 VCR对照组161 079±0 060∗27 70 427±0 040∗ VPM对照组161 365±0 062∗8 60 683±0 018∗ 0 5mg/kgVPM+VCR组161 435±0 080#3 90 215±0 019∗#△ 1 0mg/kgVPM+VCR组161 211±0 038∗#△18 90 120±0 018∗#△▲ 1 5mg/kgVPM+VCR组161 116±0 031∗#△25 30 092±0 012∗#△ 2 0mg/kgVPM+VCR组161 093±0 032∗△26 80 094±0 011∗#△ 与等渗盐水组比较，∗Plt;0 05；与VCR对照组比较，#Plt;0 05；与VPM对照组比较，△Plt;0 05；与0 5mg/kgVPM+VCR组比较，▲Plt;0 05

表2不同剂量维拉帕米和长春新碱及艾灸治疗后的瘤体重量、抑瘤率及P-gp值比较

组别n瘤体重量(g)抑瘤率(%)P⁃gp值等渗盐水组161 483±0 058-0 879±0 057 VCR对照组161 095±0 053∗26 20 426±0 032∗ VPM对照组161 386±0 086∗6 50 742±0 016∗ 艾灸对照组161 364±0 071∗8 00 549±0 021∗ 0 5mg/kgVPM+VCR+艾灸组161 442±0 067#2 80 208±0 017∗#△ 1 0mg/kgVPM+VCR+艾灸组161 219±0 049∗#△▲17 80 120±0 016∗#△◇ 1 5mg/kgVPM+VCR+艾灸组161 111±0 038∗#△▲25 10 074±0 012∗#△ 2 0mg/kgVPM+VCR+艾灸组161 085±0 035∗△▲26 80 078±0 013∗#△ 与等渗盐水组比较，∗Plt;0 05；与VCR对照组比较，#Plt;0 05；与VPM对照组比较，△Plt;0 05；与艾灸对照组比较，▲Plt;0 05；与0 5mg/kgVPM+VCR+艾灸组比较，◇Plt;0 05

3 讨 论

维拉帕米对人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR多药耐药性具有逆转效应，有研究结果表明维拉帕米可以使SGC7901/VCR的MDR1基因表达水平和P-gp糖蛋白表达降低，细胞对化疗药物的敏感性明显增加[12-14]；本文的结果显示，维拉帕米与VCR配伍使用时，有增效作用，在2.0 mg/kg剂量时，与半剂量的VCR配伍，基本能达到足剂量VCR的效果，再次证明维拉帕米对于VCR耐药的SGC7901细胞具有逆转增效作用。

艾灸确有调节肿瘤相关免疫的作用，能改善小鼠生存质量，在肿瘤免疫相关指标如细胞因子的表达等多方面证明艾灸具有免疫调节作用[15]。本文中艾灸在与维拉帕米配伍时在维拉帕米达1.5 mg/kg剂量时的降低P-gp糖蛋白表达效果明显，但在低剂量组时组间相比无显著性差异，提示艾灸需要与维拉帕米高剂量时配伍能起到好的疗效；由于艾灸所具有的调节免疫的作用，因此首先表现具有降低P-gp糖蛋白的作用，但瘤体重量、抑瘤率暂无改善；由于本实验的动物例数及艾灸的时间所限，可能影响了实验的结果，在后期的实验中将加大动物例数和增加艾灸的时间进一步考察艾灸对肿瘤生长的影响。

从本文结果可以看出维拉帕米和艾灸联合用药具有逆转SGC7901细胞VCR耐药和增效，但还需要进一步考察两者联合效价，扩大实验样本量，从而提高实验数据的可信性，以进一步验证维拉帕米和艾灸在抗肿瘤方面具有高效疗效的相关特性。

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2017-08-14;

2017-10-12)

(本文编辑：叶华珍; 英文编辑：王建东)

ReversalandsynergisticeffectofverapamilandmoxibustiononvincristineresistanceinmicewithSGC7901gastriccancer

WANG Nan，SONG Xiao-jun，JIANG Feng，XIE Xue-jian

(DepartmentofPharmacy，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion,PLA，Nanjing210002，Jiangsu，China)

ObjectiveThe purpose of this study is to investigate the effect of verapamil and moxibustion on the tumor inhibitory rate and the tumor weight and the expression of P- glycoprotein after the transplantation of vincristine (VCR) resistant SGC7901 gastric cancer in mice, so as to understand the reversal effect of these two drugs on vincristine resistance.MethodsIn first group SD mice were divided into normal saline group, vincristine control group, Verapamil control group, No.1 drug group, No.2 drug group, No.3 drug group, No.4 drug group, 16 rats in each group, Half and half on male and female, all mice inoculated with tumor tissue in the left forelimb, and administered with different doses of drugs and moxibustion. On 15 days later, inhibition rate of the tumor was calculated. At the same time for tumor specimens, changes of MDR related protein P-gp are detected. In second group SD mice were divided into normal saline group, vincristine control group, Verapamilcontrol group, Moxibustion group, No.1 drug + Moxibustion group, No.2 drug + Moxibustion group, No.3 drug + Moxibustion group, No.4 + Moxibustion drug group, 16 rats in each group, Half and half on male and female, all mice inoculated with tumor tissue in the left forelimb, and administered with different doses of drugs and moxibustion. On 15 days later, inhibition rate of the tumor was calculated. At the same time for tumor specimens, changes of MDR related protein P-gp are detected.ResultsOnly to give the Verapamil treatment, there was significant difference between the Saline group and different dose groups (Plt;0.05), the tumor inhibition rate increased and the tumor weight and protein P-gp decreased along with the increase of the drug dose; At the 1.5 mg/kg and 2.0 mg/kg, there was no significant difference in protein P-gp. To give Verapamil and Moxibustion treatment, there is also a significant difference in the saline group and different dose groups (Plt;0.05), and the tumor inhibition rate increased and the tumor weight and protein P-gp decreased along with the increase of the dose. At the dose group (1.5 mg/kg and 2.0 mg/kg) there were significant differences between the treatment group compared with group of the given only Verapamil (Plt;0.05).ConclusionVerapamil and Moxibustion on mice of Vincristine (VCR) resistant SGC7901 gastric cancer has reverse effect, and which effect can be equivalent to one of 1.0 mg/kg VCR when Verapamil is 2.0 mg/kg and VCR is 0.5 mg/kg with Moxibustion therapy.

Verapamil；Moxibustion；SGC7901 gastric cancer；Vincristine；Drug resistance；Reversalandsynergism

R9

A

1672-271X(2017)06-0587-05

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.06.007

江苏省药学会-奥赛康医院药学科研基金项目(201201)

210002 南京，南京军区南京总医院药品科

谢学建，E-mail：njzyxxj2@sina.com

王 楠，宋小骏，蒋 凤,等.维拉帕米及艾灸对长春新碱耐药胃癌细胞株SGC7901逆转增效作用[J].东南国防医药，2017,19(6):587-591.