中华绒螯蟹肠道内间质样细胞的显微和超微结构观察

李彤，张聪，张佳鑫，黄根勇，成永旭，王春，杨志刚，杨筱珍

（上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306）

中华绒螯蟹肠道内间质样细胞的显微和超微结构观察

李彤，张聪，张佳鑫，黄根勇，成永旭，王春，杨志刚，杨筱珍*

（上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306）

目的探究中华绒螯蟹（Eriocher sinensis）肠道中是否存在间质样细胞。方法通过对中华绒螯蟹中肠和后肠进行全层铺片和肠cajal间质细胞（interstitial cells of cajal, ICC）特殊染色法碘化锌-锇酸（zinc iodide-osmium, ZIO）染色，并结合后肠透射电镜观察中华绒螯蟹后肠ICC样细胞分布及形态。结果光镜检查结果显示：中华绒螯蟹间质样细胞常分布在中肠和后肠的黏膜下层。这些细胞形态相似，多为圆形或卵圆形，胞体直径约为10μm左右，呈灰黑色，常成群呈块状或片状分布，在后肠中的分布更为密集。电镜检测结果显示：这些细胞分布于黏膜下层、肌层与肌层之间和肌肉束边缘。后肠中间质样细胞多为梭形及纺锤形，也有不规则型，常有两个或两个以上突起，与邻近的细胞连接方式多为缝隙连接。此外，本研究还在后肠肠道固有膜层、肌层间和黏膜下层发现了大量颗粒细胞的分布。结论本研究通过传统的特异性ZIO染色和超微形态的观察初步发现中华绒螯蟹肠道内有ICC样细胞的分布。

中华绒螯蟹；肠道；ICC样细胞；碘化锌-锇酸染色；透射电镜

肠间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC细胞)是1893年西班牙神经解剖学家Cajal应用甲基蓝和嗜银染色法首次在在豚鼠(Caviaporcellus) 和家兔(Oryctolagus cuniculus) 小肠中发现的一种来源于中胚层的特殊间质细胞，以网状形式广泛分布于哺乳动物的消化管壁内，在调控胃肠运动中具有重要作用。虽然在水产动物鳖(pelodiseussinensis)[1]中ICC样细胞已有报道，但在甲壳动物中还未见有报道。消化道全层铺片技术作为经典研究哺乳动物肠道神经系统的方法之一，已经应用于研究甲壳动物消化道的研究[2]。本研究参照杨筱珍等[2]肠壁铺片法对我国特有的经济类甲壳动物中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 的中肠及后肠不同层分离并结合碘化锌—锇酸（zinc iodide-osmium，ZIO）染色法对ICC样细胞进行染色，对ICC样细胞形态与分布进行初步观察，ICC细胞的鉴定方法层出不穷，但是透射电镜法是认可度最高的方法之一[3]，本文通过透射电镜的方法观察后肠的超微形态，以期为甲壳动物肠道收缩相关细胞的研究奠定初步基础。

材料与方法

1 动物

2015年11月从上海市崇明中华绒螯蟹养殖基地随机挑选成年中华绒螯蟹（蟹体重82～134g）10只，实验动物均活力良好，无断肢现象，体表无明显损伤。

2 碘化锌-锇酸染色

参照Komuro等（1996年）应用的肠道间质细胞的染色方法，进行染液配制[4]。首先将2%的锇酸溶液与3%碘化锌溶液按l：3混合。两者均新鲜配制，新鲜混合。染色时，将新鲜5只中华绒螯蟹中肠和后肠迅速置于锇酸—碘化锌作用液中孵育24h（室温，不避光）后，将肠道在自来水中冲洗1h，对中华绒螯蟹中肠和后肠的基膜、肌层和黏膜下层分别进行铺片。显微镜下观察，间质细胞常呈灰黑色。

3 透射电镜样品制备

5只中华绒螯蟹后肠用河蟹生理盐水 (NaCl 14.5g; KCl 0.355g;无水CaCl20.899g; MgSO4.7H2O 1.58g; NaHCO30.25g; MgCl2.6H20 0.85g; HEPES 2.38g) 加超纯水至500ml冲洗后，固定于4℃预冷的2.5%戊二醛溶液中，1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，丙酮置换，Epon812包埋，经醋酸铀柠檬酸铅双染色，日立H-7650透射电镜观察并拍照。

结 果

1 肠铺片下肠壁内间质样细胞的形态与分布

通过对肠壁基膜、黏膜下层和肌层铺片进行碘化锌-锇酸染色观察后发现，间质样细胞仅存在于中肠黏膜下层（图1A）和后肠的黏膜下层（图1B）。该细胞为圆形或卵圆形，胞体直径约为10μm，呈灰黑色，常成群呈块状或片状分布；在基膜内未见有该细胞的分布（图1C）。由于肌层有条纹状肌纤维规律的分布，未能成功观察到此种细胞（图1D）。

比较中肠和后肠内间质样细胞的形态后发现，在两种组织中间质样细胞的形态较为接近。仅见后肠分布更为密集（图1A和图1B）。

图1 中华绒螯蟹肠道间质细胞的形态与分布（ZIO染色）。A，间质样细胞在中肠黏膜下层的分布；B，间质样细胞在后肠黏膜下层的分布；C，基膜内未出现明显ICC样细胞；D，肌层内未出现明显ICC样细胞；比例尺：A和B，50μm；C和D，100μmFig. 1 Morphology and distribution of interstitial cells of Cajal (ICCs) in the intestine of Eriocheir Sinensis (ZIO stain). A, distribution of ICCs in the midgut submucosa; B, distribution of ICCs in the hindgut submucosa; C, no ICC-like cells in intestinal basement membrane; D, no ICC-like cells in intestinal muscle layer; scale bar: 50μm in A and D; 100μm in C and D

2 透射电镜下间质样细胞的形态与分布

中华绒螯蟹后肠的间质样细胞多为梭形及纺锤形，也有不规则形，常有两个或两个以上突触，与邻近的细胞连接方式多为缝隙连接（图2A）。细胞膜常呈层叠状。胞核较大，胞质较少。胞核异染色质明显，电子密度较高，常贴近核膜分布。胞质中富含线粒体。该细胞分布部位多样，常分布于黏膜下层（图2B）、肌层与肌层之间（图2C）和肌肉束边缘（图2D），在各部位的间质样细胞形态上并无明显差异。

此外，在中华绒螯蟹后肠中也发现了大量颗粒细胞的分布，细胞主要形态为圆形或卵圆形，胞质内有大量高电子密度大小不一的圆形或卵圆形颗粒。常分布在固有膜层、肌层间和黏膜下层（图2E-G）。

图2 中华绒螯蟹肠道间质细胞和颗粒细胞超微结构特征。A，间质样细胞与周围细胞间的缝隙连接（箭头示）；A’，A中箭头处放大；B，黏膜下层下的间质样细胞；C，肌间间质样细胞；D，肌束边缘间质细胞；E，固有膜内成群的颗粒细胞（箭头示）；F，肌层间颗粒细胞（箭头示）；G，黏膜下层的颗粒细胞（箭头示）；N，间质样细胞细胞核；EC，肠上皮细胞；SM，平滑肌细胞；MB，肌束；c，角质层；比例尺：A和A'，2μm；B—D和F，5μm；E和G，10μmFig. 2 Ultrastructure characters of interstitial cells of Cajal (ICCs) and granulocytes in the intestine of Eriocheir Sinensis. A, gap junctions between ICCs and their neighboring cells indicated by arrows; A’, enlarged image of the region indicated by arrows in A; B, ICCs in the submucosal tissue; C,Intermuscular ICCs; D, ICCs around muscle bundles; E, granulocytes in the lamina propria; F, intermuscular granulocytes; G, granulocytes in the submucosal tissue; N, the nucleus of ICC; EC, epithelial cells; SM, smooth muscle cell; MB, muscle bundle; Cu, cuticle. Scale bar, 2μm in A and A’; 5μm in B to D and F; 10μm in E and G

讨 论

ICC细胞是胃肠平滑肌的收缩起搏细胞，调控着胃肠道的基本电节律，且在胃肠道运动中发挥着重要的功能。目前有关ICC细胞的形态与功能的研究在哺乳动物鼠(Mus culus)[5]、猪(Sus scrofa)[6]、水产动物鳖[1]等中已有大量报道。其形态虽然在不同种属及胃肠道的不同部位存在一定差异，但此类细胞的形态具有一定的相似性特征。目前已公认ZIO染色法[7]和特征性的超微结构是识别ICC细胞的传统方法。ICC细胞的超微结构常有以下几个典型特征：1）细胞突起明显；2）细胞间常为缝隙连接；3）胞浆中广泛分布内质网、高尔基体和线粒体，基底膜不连续存在，并且质膜为穴样凹陷；4）胞核中异染色质较多[8]。我们之前的大量研究已表明，中华绒螯蟹肠道组织结构有明显的特殊性，如其中肠无明显固有层、后肠有较厚的肌肉层、中肠与后肠均为直线形且两部分之前有肠球连接等[9]。但其功能与其它动物是否存在差异，有何种差异还有待于进一步证实。经过大量研究，我们已在中华绒螯蟹肠道中发现有肥大细胞、5-HT和5-HT受体2的分布，同时研究表明外源组织胺能影响肠道消化功能和结构[9-13]。本研究通过借助传统识别ICC细胞的方法，初步发现在中肠和后肠内均有ICC样细胞的分布。在光镜下仅见黏膜下层有分布，这与赵柳兰等[11]发现此层也是后肠肥大细胞常出现在部位相类似。我们认为由于肌肉层厚于黏膜下层，可能是本研究通过肠道铺片未能观察到这一细胞的原因之一。此后，通过电镜观察所获得的ICC样细胞其超微结构符合已报道的其它动物ICC细胞的特征，其中包括细胞常见突起、细胞间及与平滑肌细胞间可见缝隙连接，除此之外，我们在超微结构观察下还发现中华绒螯蟹ICC样细胞细胞膜常呈层叠状。结合光镜下特异性染色的观察，我们初步认为我们所观察的细胞为肠间质细胞。虽然这类细胞并未发现有以往对肠道间质细胞所描述的胞膜存在小凹及不连续的基膜的结构，但这样的差异也许与种属特异性有关。

ICC 分类方法很多，目前的研究多以 Sanders的分类为参照标准，此方法主要根据ICC细胞的分布部位来分类，共分为四类：1) 肠肌丛 ICC（myenteric ICC，ICC-MY），位于环肌层和纵肌层之间；2) 深肌层丛ICC（deep muscular plexus ICC，ICC-DMP），位于环肌较厚的外层与较薄的内层之间；3) 黏膜下ICC）（submucosal ICC，ICC-SM），位于环肌与黏膜下层间；4)肌内 ICC（intramuscular ICC，ICCIM），位于环形肌肌束内与纵形肌肌束内。由于中华绒螯蟹肠道结构与哺乳动物有很大差异，肌肉层很薄，且仅在后肠中较为发达[9]。结合本研究超微结构的观察，我们将中华绒螯蟹的ICC样细胞分为三类，它们分别为：1）分布在肌层细胞间的ICC样细胞；2）黏膜层与黏膜下层间的ICC样细胞；3）肌肉束边缘的ICC样细胞。不少学者[14]已对不同胃肠道不同部位的各种类型ICC功能进行研究后发现，同一类型ICC在不同部位中功能存在差别，如：ICCMY 是胃和小肠的起搏细胞，能自动去极化，产生电慢波节律；而结肠的起搏细胞为 ICC-SM；ICC-IM和小肠的 ICC-DMP 及结肠的 ICC－MY 则参与介导兴奋性和抑制性神经传递，与胃肠运动神经调控密切相关。综上，在中华绒螯蟹后肠中此三种ICC样细胞的功能如何还有待于进一步澄清。

本研究通过电镜观察后发现中华绒螯蟹肠道固有膜层、肌层间和黏膜下层内有单个或成群分布的颗粒细胞。此类细胞形态特征与肥大细胞非常相似如分布在血管外的组织内、常成群分布、胞体圆而大，胞核偏于胞体的一侧，胞质中充满高电子密度的圆形或卵圆形颗粒等。目前有关此类细胞已在多种动物肠道内有分布且发挥着肠道免疫的防疫功能[15]。我们通过甲苯胺蓝以及阿尔新蓝-番红染色法发现中华绒螯蟹后肠中有肥大细胞阳性细胞的分布[11]。由于蟹类是开放式循环，此类细胞是否为血细胞中的颗粒细胞还是与其它动物所述的肥大细胞一致还需进一步验证，而其在肠道中发挥的生理作用还有待于进一步证明。

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Microstructure and ultrastructure of the interstitial cells in the intestine of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)

Li Tong, Zhang Cong, Zhang Jiaxin, Huang Genyong, Cheng Yongxu, Wang Chun, Yang Zhigang, Yang Xiaozhen*
( Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306，China)

ObjectiveTo explore the existence of interstitial cells of cajal (ICCs) in the intestine of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis ).MethodsThe distribution and morphology of ICC cells from the intestine ofEriocheir sinensiswere studied using both light and transmission electron microscopy through whole mount prepared and zinc iodide osmium (ZIO) stained mid- and hindgut tissue samples.ResultsICCs mainly distributed in the submucosa of midgut and hindgut under light microscopy. These grayish black cells were similar in shape which were round or oval with a diameter of around 10 μm. Cells grew in clusters or patches. The cell density in the hindgut was higher than that in the midgut. Under electron microscope, ICCs mainly distributed in submucosa, between muscle layers, or around muscle bundles. They were either spindle-like or irregular with two or more projections and connected with adjacent cells mostly through gap junctions. In addition, a large number of granulosa cells were found in the lamina propria, muscular layers and submucosa of hindgut.ConclusionThe existence of ICC cells was con firmed in the intestine ofEriocheir sinensiswith distinct distribution and morphology.

Eriocheir sinensis; gut; interstitial cells of Cajal; ZIO; ultrastructure

Q952.4

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 06. 003

2017-05-28

2017-12-06

国家自然科学资金（31272677；31472287）；上海市科委项目：上海水产养殖工程技术研究中心

（16DZ2281200）；上海市高校知识服务平台（ZF1206）；水产动物遗传育种上海市协同创新中心(ZF1206)；上海市科技兴农推广项目：中华绒螯蟹养殖技术的推广应用沪农科推字(2015)第1-7号

李彤，女（1990年），汉族，硕士研究生

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：xzyang@shou.edu.com