丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对病毒性心肌炎模型小鼠冠状动脉血管内皮损伤的保护作用*

许丽琴 曹 觅 余 莉 潘 军 齐旭升

（湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000）

病毒性心肌炎（VMC）是儿科心血管系统的感染性疾病，多由水痘病毒、腺病毒、风疹病毒、流感病毒、柯萨基B族病毒等肠道病毒感染有关，其中尤以柯萨奇病毒B为多见［1］。由于学龄前及学龄期儿童免疫力较成年人低，易受上述疾病感染导致心肌炎症性病变，多数患儿预后良好，但亦有少数患儿感染后迁延不愈，严重者可发展为扩张型心肌病或致残性心律失常，少数患儿或因并发急性心力衰竭和心源性休克而导致死亡［2］。研究表明，病毒性心肌炎患儿心肌细胞往往因病毒侵蚀、缺血及氧自由基等多重因素影响而导致严重的心肌损伤，因此在治疗病毒性心肌炎时，多以抗病毒、清除氧自由基、营养心肌、免疫调节等综合治疗为主。因病毒性心肌炎患儿存在较严重的心肌损害，且目前尚缺乏特异、有效的治疗手段，故中西医结合治疗逐渐受到重视，丹参酮ⅡA磺酸钠注射液具有特异性阻滞Ca2+内流、抑制“钙超载”的药理特性，可抑制心肌细胞炎症反应、扩张心衰和心源性休克患者冠状动脉、增加组织灌流量、增强心脏泵血功能等作用，临床用于急性心肌梗死、病毒性心肌炎等心血管疾病的辅助治疗［3-4］。因其对病毒性心肌炎的治疗缺乏相关的实验研究，故本课题组采用柯萨奇病毒B3（CVB3 Nancy株）腹腔接种于Balb/c小鼠的方法建立小鼠病毒性心肌炎模型，并在此基础上静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液，观察其对病毒性心肌炎模型小鼠冠状动脉血管内皮损伤的影响，探讨其干预作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性纯种同源近交系Balb/c小鼠 60 只，4 周龄，体质量（18.5±1.5） g，购自湖北医药学院实验动物中心。

1.2 药物及试剂 实验用病毒CVB3 Nancy病毒株由太和医院生物医学研究所提供，使用前将CVB3病毒液终浓度调至100TCID 50/0.1 mL；丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（上海第一生化药业有限公司生产，批号1606105，规格 2 mL∶10 mg）； 小鼠血管内皮因子（VEGF）ELISA试剂盒、VEGFmRN反转录试剂及血管内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 造模及分组 挑选体质量接近的Balb/c小鼠40只，每只按0.1 mL腹腔注射接种CVB3 Nancy病毒液，连续注射3 d后可建立稳定小鼠病毒性心肌炎模型。于接种10 d后随机分为病毒性心肌炎模型组（VMC组）和丹参组（DST组），另外20只腹腔注射等体积0.9%氯化钠注射液作空白对照组（BCG组）。

1.4 干预方法 丹参组和心肌炎模型组小鼠在注射CVB3 Nancy病毒液的第11日起，丹参组腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液0.2mL/只，心肌炎模型组和空白对照组每日腹腔内注射等体积0.9%氯化钠注射液0.2 mL/只，每日1次，连续注射治疗10 d。

1.5 标本采集与检测 于治疗前后，每组取10只，抽取静脉血，采用酶联免疫吸附法检验小鼠血清肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶 MB（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）。 取血后处死实验小鼠，摘取心脏，迅速分离出冠状动脉血管，采用免疫组化染色检测冠状动脉内诱导型iNOS的表达，双抗体夹心法测定冠状动脉VEGF表达，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测冠状动脉血管VEGF mRNA。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0软件统计。计量资料以（±s）表示，各组指标先采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组治疗前后小鼠血清心肌酶谱水平比较 见表1。丹参组和心肌炎模型组小鼠在治疗前心肌酶谱中CK、CK-MB和LDH均明显升高，与空白对照组比差异有统计学意义（P＜0.05），且丹参组和心肌炎模型组小鼠在治疗前CK、CK-MB和LDH比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示腹腔注射接种CVB3 Nancy病毒液建立病毒性心肌炎模型成功。治疗后，心肌炎模型组小鼠CK、CK-MB和LDH仍然保持在高水平，与空白对照组比差异有统计学意义（P＜0.05）。而丹参组则明显降低并接近空白对照组水平，与治疗前和心肌炎模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组治疗前后小鼠血清心肌酶谱比较（IU/L，±s）

表1 各组治疗前后小鼠血清心肌酶谱比较（IU/L，±s）

与本组治疗前比较，*P＜0.05；与空白对照组同时期比较，△P＜0.05；与心肌炎模型组比较，▲P＜0.05。下同。

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2.2 各组治疗前后小鼠血清脂质过氧化反应情况比较 见表2。丹参组和心肌炎模型组小鼠在治疗前SOD明显低于空白对照组，MDA明显高于空白对照组，与空白对照组比差异有统计学意义（P＜0.05），丹参组和心肌炎模型组小鼠在治疗前SOD和MDA比差异无统计学意义（P＞0.05），提示成模后脂质过氧化反应活跃，小鼠心肌受损严重。治疗后，心肌炎模型组小鼠SOD和MDA无明显变化，与空白对照组比差异有统计学意义 （P＜0.05）。而丹参组SOD明显升高，MDA明显降低并接近空白对照组水平，与治疗前和心肌炎模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示治疗有效。

表2 各组治疗前后小鼠血清SOD及MDA、iNOS阳性细胞数比较（±s）

表2 各组治疗前后小鼠血清SOD及MDA、iNOS阳性细胞数比较（±s）

组 别 时 间 SOD（IU/L） MDA（IU/L）iNOS阳性细胞数（个/100）空白对照组 治疗前 304.98±42.75 1.43±0.184.59±0.53（n＝10） 治疗后 308.25±37.82 1.39±0.114.42±0.45心肌炎模型组 治疗前 142.73±17.24△ 11.07±1.24△35.24±2.86△（n＝10） 治疗后 148.55±16.37△ 10.72±2.03△37.46±2.53△丹参组 治疗前 149.52±15.80*△▲ 1.64±0.20*△▲ 34.85±3.07*△▲（n＝10） 治疗后 301.49±37.52*△▲ 1.30±0.15*△▲ 5.01±0.39*△▲

2.3 各组小鼠冠状动脉血管内皮iNOS表达情况比较见表2。心肌炎模型组治疗前后冠状动脉血管内皮iNOS阳性细胞数均明显增多，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。而丹参组治疗前iNOS也明显增多，与空白对照组比较（P＜0.05），治疗后则显著降低，与治疗前和心肌炎模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 各组治疗前后小鼠冠状动脉血管VEGF、VEGF mRNA表达情况比较 见表3。实验检测到丹参组和心肌炎模型组小鼠在治疗前后VEGF、VEGFmRNA均有一定程度升高，与空白对照组比差异有统计学意义（P＜0.05），提示小鼠心肌对CVB3 Nancy病毒造成心肌炎症反应会在一定程度上促进冠状动脉血管VEGF及VEGFmRNA表达。丹参组和心肌炎模型组小鼠在治疗前VEGF及VEGFmRNA比差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，心肌炎模型组小鼠VEGF及VEGF mRNA无明显变化，与空白对照组比差异有统计学意义（P＜0.05）。而丹参组则明显升高并高于空白对照组水平，与治疗前、空白对照组和心肌炎模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组治疗前后小鼠冠状动脉血管VEGF、VEGFmRNA比较（±s）

表3 各组治疗前后小鼠冠状动脉血管VEGF、VEGFmRNA比较（±s）

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3 讨 论

病毒性心肌炎属中医学“心悸”“风温”“怔忡”等范畴，在发病初期，入侵的病毒对心肌细胞造成直接损伤，大量增殖的病毒会引起心肌细胞缺氧和缺血，持续生成氧自由基会造成心肌细胞膜、冠状动脉血管内皮及线粒体功能受损，心肌能量代谢发生障碍［5-6］。因此，如不及时、准确地诊治，患儿可能发生心力衰竭、心源性休克等并发症导致死亡。临床在救治病毒性心肌炎合并心力衰竭患儿时，应用中药制剂辅助治疗可提高治疗效果，如在本研究中应用的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液就具有抑制炎症反应、清除氧自由基，降低血液黏稠度、扩张冠状动脉，增加缺血心肌组织血液流量，增强心力衰竭心肌收缩力和心脏泵血功能作用［7-9］。另有研究发现，丹参酮ⅡA能通过多种信号通路和途经抑制繁殖病毒或直接杀灭病毒，对病毒性心肌炎心肌细胞具有显著的保护作用［10-11］。丹参还具有活血通经、凉血消痈、理气止痛及活血化瘀的中药药理特性，可增加血管通透性，临床被广泛用于心脑血管疾病的治疗［12］。

本研究发现，治疗后丹参组血清CK、CK-MB、LDH及MDA较治疗前和心肌炎模型组明显降低、SOD明显提高，这提示丹参酮ⅡA磺酸钠注射液可提高SOD含量，增强机体清除氧自由基的能力，有效降低脂质过氧化反应对心肌及冠状动脉的损伤，心肌血清心肌酶谱CK、CK-MB、LDH及脂质过氧化反应产物MDA明显降低正是这一作用结果的有力证据。iNOS为一氧化氮（NO）诱导酶，iNOS必须经炎性因子如细菌内毒素或细胞因子等刺激才会在细胞上表达［13］。iNOS一旦诱生即会诱导催化产生大量NO，发挥非特异性免疫防御或免疫损伤作用，引起细胞线粒体呼吸抑制及DNA损伤，其直接结果会加重脂质过氧化反应，而脂质过氧化产物MDA又会造成血管内皮细胞严重损伤而加重心肌细胞及冠状动脉血管内皮损伤［14-15］。在对小鼠血管内皮进一步观察，笔者发现心肌炎模型组治疗前后冠状动脉血管内皮iNOS阳性细胞数均明显增多，且高于空白对照组）。而丹参组治疗前iNOS也明显增多，且高于空白对照组，治疗后则显著降低，与治疗前和心肌炎模型组比较差异有统计学意义，提示CVB3 Nancy病毒感染会造成冠状动脉血管内皮损伤，而丹参酮ⅡA磺酸钠注射液可显者降低iNOS的阳性表达，说明丹参酮ⅡA磺酸钠注射液可以降低CVB3 Nancy病毒感染造成的冠状动脉血管内皮损伤，故抑制iNOS的合成也是丹参酮ⅡA磺酸钠注射液保护冠状动脉血管内皮的重要机制之一。实验中，笔者还观察到丹参组和心肌炎模型组小鼠在治疗前后VEGF、VEGFmRNA均有一定程度升高，与空白对照组比差异有统计学意义，这提示小鼠心肌对CVB3 Nancy病毒造成心肌炎症反应会在一定程度上促进冠状动脉血管VEGF及VEGFmRNA表达。治疗后，心肌炎模型组小鼠VEGF及VEGFmRNA无明显变化，与空白对照组比差异有统计学意义。而丹参组则明显升高并高于空白对照组水平，与治疗前、空白对照组和心肌炎模型组比较差异有统计学意义。这提示丹参酮ⅡA磺酸钠注射液还具有促进受损冠状动脉血管VEGF及VEGFmRNA表达的作用。VEGF是一类具有诱导血管内皮细胞增殖、促进血管新生的一种高度特异性的促血管生长因子［16］。受损的冠状动脉血管内皮在高表达的VEGF作用下，大量血管内皮细胞增殖迁移再生，侧支循环迅速形成，缺血心肌灌流量增加，这也有利于受损心脏功能恢复［17］。

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