微小RNA在重症肌无力免疫调节机制作用的研究进展

王宇 王丽华 王健健 张荟雪

重症肌无力(myasthenia gravis， MG)是指主要由乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine receptor antibody， AChR-Ab)介导、细胞免疫依赖、补体和细胞因子参与，主要累及神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)突触后膜乙酰胆碱受体(AChR)的获得性自身免疫性疾病[1]，其临床特点主要是活动后加重、休息或应用胆碱酯酶抑制剂或免疫制剂治疗后减轻，晨轻暮重的部分或全部骨骼肌无力和极易疲劳，严重时可出现肌无力危象而危及生命。MG的发病机制目前仍不明确。

近年来的多项国内外研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)作为一类重要的转录后调节因子，在各种自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病等)患者或动物模型中表达异常，在疾病发生发展中发挥关键性作用。目前，多项实验研究业已证实miR-146a、miR-155、miR-320a、miR-181c、let-7c、miR-125a-5p、miR-145、miR-15a、miR-15b、miR-19b等在MG的发病中具有重要意义，同时还发现miR-20b、miR-21-5p、miR-23b、miR-27-3p、miR-29、miR-206、miR-223、miR-362-3p、miR-635、miR-151a-3p、miR-423-5p、let-7a-5p、let-7f-5p等多种新型miRNAs可能影响MG的发生发展。现有研究已证实miRNAs参与免疫细胞分化、增殖及抗体、补体、细胞因子产生和分泌等一系列生物进程。因此，了解MG中免疫相关miRNAs的研究进展及其发病机制对MG 的诊断及治疗有重大意义。本文将从miRNAs在MG中对T细胞亚群及细胞因子、B细胞及其补体、抗体等的免疫调节作用及其机制的研究进展进行综述。

1 miRNA的生物合成及功能

miRNAs是一类内源性单链非编码小分子RNA，长度为18～25个核苷酸，其种子序列通过与靶基因3′端非编码区(untranslated regions， UTRs)特异性结合导致信使RNAs(messenger RNAs， mRNAs)降解或翻译抑制，从而在转录后水平调控基因表达，参与免疫应答的调节，致使自身免疫性疾病发生和进展。

miRNA基因首先在细胞核内转录成为没有特定结构的前体(称为原始miRNA)，再由核糖核酸酶Ⅲ中的Drosha酶在核内加工，产生大约65个核苷酸长度的发夹样miRNA中间体，进入胞质后由其内的Dicer酶(也是核糖核酸酶Ⅲ的一种)加工，产生成熟的单链miRNA。单链miRNA是RNA介导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)的组成部分，其功能是引导RISC作用于特定mRNA，按照碱基互补配对原则与mRNA的3′-UTR序列相互作用，从而抑制mRNA翻译成蛋白质或降解mRNA而发挥负调控基因表达的作用[2]。一个miRNA可以调控多个mRNAs，而同时一个mRNA也可以受到多个miRNAs的调节。

2 miRNA在MG相关T细胞亚群及细胞因子中的作用

2.1CD4+T细胞CD4+T细胞也称为辅助性T细胞(helper T cell ，Th)，包括Th1、Th2和Th3细胞3个亚群。MG患者Th1和Th2细胞可能通过分泌细胞因子作用于AChR特异性B细胞，增强体液免疫活性，而Th3细胞主要通过分泌转化生长因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β)发挥其抑制性作用[3]。

2.1.1Th1细胞：Th1细胞特异性细胞因子包括白细胞介素-2(IL-2)、IL-12、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，特异性细胞因子，它们可以启动细胞免疫应答。IL-2是其中最重要的一种，可诱导Th1细胞增殖及产生IFN-γ、促进B细胞增殖及分泌抗体，起免疫增强作用。IFN-γ刺激B细胞成熟并促进AChR-Ab的产生、诱导实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)临床表现的产生。Cheng等[4]的研究发现，miR-320a在MG患者中表达下调；进一步发现miR-320a通过靶向调节丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)而参与细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)/核转录因子-κB(NF-κB)通路诱导环氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)的表达，进而促进炎性细胞因子IL-2、IFN-γ的表达而参与MG的发病，该作者还认为miR-320a有望成为MG新的治疗靶点这一点。

2.1.2Th2细胞：Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-9、IL-10等细胞因子，可促进B细胞增殖、分化和抗体的形成，启动体液免疫。其中IL-10是一种由T细胞B细胞和巨噬细胞产生的多效细胞因子，具有抗炎和免疫抑制的作用。Jiang等[5]利用基因芯片技术对MG患者及健康人外周血中的单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMCs)进行miRNAs表达谱检测，与健康对照组相比，发现MG患者存在多个差异表达的miRNAs。进一步通过低通量实验证实了MG患者体内misRNA let-7c显著低表达，通过功能分析表明其能调控多个MG相关的细胞因子的表达，尤其是let-7c可以通过负性调控IL-10的表达参与MG发病及进展。

2.1.3Th3细胞：Th3细胞可以分泌一种内源性免疫抑制性细胞因子TGF-β。该因子可以抑制Th1细胞介导的免疫应答和炎性反应；抑制B细胞、T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)及活化噬细胞等免疫细胞增殖和分化并降低其活性；抑制IFN-γ、TNF-α等炎性细胞因子的生成。有学者报道，MG患者PBMCs中TGF-β水平高于正常对照组，且TGF-β水平与病程有关[3]。T细胞中TGF-β信号通路缺失后大多数miRNAs表达下调，而miR-21及其他少数miRNAs表达上调。野生型小鼠B6T细胞转染miR-21后IFN-γ和TNF-α表达升高，部分模拟了TGF-β受体Ⅱ缺失小鼠的表型，诱发自身免疫性胆管炎和结肠炎[6]。TGF-β信号系统可以负性调控NF-κB转录活性，敲除TGF-β信号后，NF-κB转录活性增强，进而导致miR-21过表达。MG患者血清中miR-21表达量也同样增加[7]，其有可能通过上述机制导致MG起病。MG患者血循环中的miR-20b负性靶向调控IL-8、IL-25表达，且糖皮质激素治疗数月后其表达量可恢复正常[8]，然而其机制并不明确，同时有研究表明miR-20b在非小细胞肺癌中可以直接抑制TGF-β受体Ⅱ减弱TGF-β信号通路[9]，推测miR-20b很可能通过作用于TGF-β信号通路调节IL-8和IL-25表达，促使MG的发生。但miR-20b和miR-21是否通过调控细胞因子TGF-β的分泌和表达导致MG发病这一问题仍有待于进一步研究证实。

2.2Treg细胞人类自身免疫疾病通常具有Treg细胞相对缺乏的特点。体内大部分Treg细胞产生于正常胸腺组织，叉头框P3(Fork head box P3， FOXP3)是Treg细胞的生成及行使免疫抑制功能的关键性转录调节因子，其表达下调可导致Treg细胞功能丧失[10]。FOXP3表达下调可使胸腺自身免疫耐受机制遭到破坏，引发胸腺瘤患者发生包括MG在内的自身免疫性疾病。现有研究表明，miR-125a-5p在MG的FOXP3表达中重要具有调节作用。Li等[11]利用新一代基因测序技术和低通量实验发现MG伴胸腺瘤患者胸腺内miR-125a-5p显著高表达；共转染及双荧光素酶报告检测结果表明miR-125a-5p与FOXP3存在靶点关系；miR-125a-5p对FOXP3有明显的下调作用；进一步体外实验研究发现miR-125a-5p负性调节基因的转录后表达，更加证实miR-125a-5p对基因FOXP3的调控作用。由上可见，在MG伴胸腺瘤患者胸腺组织中miR-125a-5p可能通过负性调节FOXP3表达，引起Treg细胞的功能失调，导致自身免疫调节的失衡，参与MG的发病过程。

2.3Th17细胞除CD4+T细胞及其分泌的细胞因子外，还有另一种细胞亚群参与诱导MG的发生，这类细胞被称为Th17细胞。现有研究表明，多种miRNAs调节Th17细胞的生物进程或IL-17等的分泌，可导致MG的发生和进展。Liu等[12]研究发现miR-15a参与调节MG患者炎性细胞因子的表达，实验证实在MG患者体内干扰素-γ诱导蛋白10(CXCL10)是miR-15a的一个直接靶基因；miR-15a的表达下调导致CXCL10的表达上调，增加IL-17、IFN- γ的表达。国内一研究组制备EAMG大鼠动物模型，首先采用微阵列方法检测EAMG大鼠模型和健康大鼠PBMCs中miRNAs的表达谱，确认了11种两组间差异表达的miRNAs；进一步通过体外实验证实了miR-145在EAMG大鼠模型体内表达量显著下调，并导致其两个靶蛋白CD28和NFATc1过表达，从而促进T细胞增殖和Th17细胞分化[13]。另一项研究表明MG患者PBMCs内miR-181c的低表达导致IL-7和IL-17的高表达，从而导致MG发生[14]。MiR-19b-5p作为一种致癌性调节因子在MG伴胸腺瘤患者中高表达，其负性调控胸腺基质淋巴细胞生成素的表达，从而影响Th17细胞的发育以及相关细胞因子包括IL-17、IL-1β、IL-6和IL-23的分泌，推测将来miR-19b-5p有可能成为MG和胸腺瘤的诊断标志物或治疗靶点[15]。

3 miRNA在MG相关B细胞及补体的作用

B细胞起源于骨髓，发育成熟后进入人体各个外周淋巴器官，它是体液免疫的主要细胞。某些miRNAs表达异常，导致B细胞数量变化、功能缺陷或过度激活等。其相关补体和细胞表面分子也发生紊乱，从而出现大量自身抗体的释放，攻击NMJ处的结构，引起MG的发生发展。

3.1CD19CD19是主要表达于B细胞膜中的一种跨膜蛋白，是B细胞抗原识别与摄取状态的关键标记物。它通过介导活化B细胞与抗原间的作用来维持B细胞的活性。Lu等[16]研究miR-146a在MG的作用时，从C57BL/6小鼠体内提取CD19+B细胞供体外实验应用。Zhang等[17]对B细胞miR-146a的基因沉默与EAMG治疗机制相关性进行研究时，同样使用CD19磁珠提纯B细胞进行实验。目前仍没有对CD19-B细胞在MG作用机制的相关研究进行对比，但不可否认CD19作为跨膜蛋白在MG中发挥着关键性作用。

3.2B细胞活化因子受体(BAFF-R) BAFF-R属于肿瘤坏死因子受体家族的一员，主要功能是介导B细胞分化和增殖，并维持B细胞存活。有研究表明MG患者血清中BAFF-R表达增多，外周血中CD19+BAFF-R+B细胞明显增加，提示其可能与MG发病机制有关，故该研究者提出一模型假说，认为“活化的BAFF/BAFF-R信号通路激活NF-κB从而导致EAMG/MG 中miR-146a表达的异常”[17]。Wang等[18]的动物实验表明miR-155沉默后损害BAFF-R信号通路，减少NF-κB向核内转移，从而缓解EAMG的表现，表明miR-155的低表达对治疗人类MG具有一定的意义。

3.3CD40、CD80、CD86T细胞驱使B细胞产生自身抗体需要抗原信号与共刺激信号两个系统。共刺激分子包括CD40、CD80、CD86，它们可以参与细胞活化过程中的信号传导，调控B细胞增殖、分化和凋亡[19]。现有研究表明，miR-146a可能在AChR特异性B细胞活动调节和免疫反应中发挥重要作用，从而导致MG的发病。Lu等[16]研究表明与健康对照组相比，MG患者miR-146a的表达水平显著升高，细胞表面共刺激分子和Toll样受体4、NF-κB蛋白水平显著减少。Zhang等[17]动物实验证明miR-146a敲除后出现多种B细胞功能缺陷，包括B-1细胞、记忆性B细胞和浆细胞数量下降，CD40、CD80、CD86表达下调，血清AChR-Ab表达及抗体类型转换受损，缓解EAMG肌无力症状，故沉默miR-146a可能成为治疗MG的有效方法。

4 miRNA在MG相关抗体中的作用

现有研究发现，miRNA在主要的MG相关抗体，如AChR-Ab、抗骨骼肌酪氨酸激酶(muscle specific tyrosine kinase antibody， MuSK)抗体、抗低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)抗体和抗肌联蛋白(Titin)抗体中可能均具有一定调节作用。

4.1AChR-AbAChR是MG中的最主要的自身抗原，临床上发现60%～80%MG患者存在AChR-Ab。现有研究表明，miR-146a在MG患者AChR-Ab调节中发挥了一定作用。Lu等[16]体外模拟MG的发病机制，使用电鳗AChR-α 146-162片段刺激B细胞，证明鼠AChR特异性B细胞接受刺激后miR-146a显著高表达，且该现象可被AntagomiR-146a所削减。Zhang等[17]发现，建立的EAMG动物模型中敲除B细胞miR-146a后，AChR-Ab产生及抗体类别转换将减少，可见miR-146a可能通过调节B细胞活性、AChR-Ab产生及类别转换导致MG的发生。还有研究发现，miR-155也可能通过调节AChR-Ab类别转换导致MG的发生。Chen等[20]发现，全身型MG患者外周血B细胞中miR-155的相对表达量高于健康对照组，且地塞米松干预组miR-155相对表达量低于PBS 组，其培养上清中抗AChR-IgG1的水平也低于 PBS组，可见糖皮质激素可以抑制全身型MG患者miR-155的表达，推测其可能是通过调节AChR-Ab类别转换发挥治疗作用。

4.2MuSK-Ab与AChR-Ab不同， MuSK-Ab的主要成分是IgG4，而不是IgG1。IgG4通过干扰LRP4-MuSK的结合来抑制MuSK的激活，这也被认为是MuSK-Ab致病的主要机制之一[21]。MuSK-Ab阳性MG患者约占MG患者总数的5%～7%。Punga等[22]为了证实MuSK-Ab阳性MG患者血清中是否存在特异性的miRNAs进行了一项研究。研究表明let-7a-5p、let-7f-5p、miR-151a-3p和miR-423-5p明显高表达，这些miRNAs有可能成为除抗体滴度以外MuSK-Ab阳性MG患者血清特异性的生物标志，但尚需进一步深入研究。

4.3抗LRP4抗体和抗Titin抗体近年研究发现，LRP4是Agrin-LRP4-MuSK-Dok7信号传导通路的重要组成部分。它与运动神经元释放的集聚蛋白Agrin结合后可激活MuSK，并导致AChR的聚集，进而促进NMJ的形成。小部分MG患者血清AChR-Ab和MuSK-Ab均呈阴性，这部分MG被称之为血清双阴性重症肌无力。在血清双阴性重症肌无力患者中检测出LRP4-Ab阳性[23-24]。Titin抗体属于横纹肌抗体的一种，研究发现重症MG患者血清Titin-Ab比轻症者容易检测到，说明MG严重程度与Titin-Ab滴度有一定的相关性，并且Titin-Ab与胸腺瘤密切相关[25]。目前，与此两种抗体相关的研究尚少，miRNA对其的作用尚待研究。

综上可见，MG是一种神经系统的自身免疫性疾病，其免疫学发病机制备受关注，包括自身抗体的产生、免疫细胞功能受损以及其分泌的细胞因子失衡等。miRNA作为一类重要的转录后调节因子，在MG发生发展中发挥关键性作用，其中miR-146a、miR-155等有望成为MG治疗靶点。因此，研究miRNA在MG免疫调节机制的作用，可为临床分子诊断和个体化治疗提供新思路。目前，如何精确地通过相关技术检测MG特异性miRNA及其靶基因，并在miRNA水平上阐述MG的发病机理，仍然是未来研究的一大难题。分子生物学和免疫学技术的发展将会促进对MG免疫学发病机制的认识和探讨，为其临床治疗提供新策略。

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