纳米孔测序技术在病毒基因组研究中的应用

王佶 马学军

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

早在20世纪90年代，人们就提出可以使用纳米孔传感器对DNA进行序列分析。自1996年PNAS发表的第1篇纳米孔测序的报道开始，针对这种技术的研发工作就正式拉开帷幕。Oxford Nanopore Technologies (ONT) 公司开发出了商业化的纳米孔测序仪—MinION。ONT于2014年春季推出了MinION Access计划，旨在邀请全球各国学者共同体验MinION的使用，并协助完善其在各个领域的应用。也正是在那时起，有关纳米孔测序的评估报告和学术研究开始不断涌现在多个研究领域。

1 纳米孔测序的原理

每1张与MinION配套使用的Flow Cell上都有512个传感器，每个传感器连接4个生物纳米孔，这些纳米孔嵌入在人造膜中。测序文库中的DNA末端有特殊的“Y”型接头并连接一个马达蛋白。测序开始后，MinION对膜两侧施加电压，马达蛋白打开双链DNA并引导其中一条单链穿过纳米孔。孔中的碱基会造成穿孔电流的中断，这种电流变化反映了DNA的序列信息。MinION每秒钟可对穿孔电流测量上千次，并通过名为MinKNOW的软件将数据写入本地硬盘。MinION每产生一条read就会生成一个FAST5文件，用户可利用不同的生物信息学分析流程从中提取所需要的信息；也可以通过选择恰当的运行脚本来同时进行测序和碱基识别，这将产生FAST5和FASTQ两种格式的数据集[1-3]。

2 纳米孔测序的特点

相对于二代测序技术平台(Second-Generation Sequencing，SGS)，MinION的主要特点是读长长、简单快速、便携性高且可以实时分析测序数据。这些特点将进一步推动和改善现有的病毒基因测序工作，各国的研究人员也已经逐步将MinION应用于病毒检测、病毒全基因组测序、新病毒的发现、病毒准种与进化研究等领域。

2.1Reads长度长MinION产生的reads可长达882 Kb[4]，这足以覆盖绝大多数病毒的全基因组。较长的reads有助于减少数据组装的难度，并且能更清楚地辨别基因组中的重复序列与复杂结构。Elizabeth等[5]利用MinION分析缺陷型和野生型兽棚病毒(Flock House virus)基因组的全长，结合ClickSeq技术确定了RNA重组事件之间的相关性，并对病毒传代过程中不同的缺陷干扰RNA的相对丰度做出量化。对于结构复杂且GC含量高的病毒基因组，仅利用SGS数据难以测得全长。通过混合组装Roche 454和MinION的reads，研究者成功测得了长达152 kb的人类疱疹病毒Ⅰ型的基因组[6]，应用该方案对7个样本的数据进行组装，观察到7个样本的N(G)50和N(G)75全部有所增加，其中6个样本的重叠群数量减少。该方法还从一例样本中检测到独有序列和重复序列区之间的重排，这一现象仅用SGS的短reads是无法发现的。

2.2便携性高2014—2016年西非地区的埃博拉病毒病爆发造成了上万人死亡，对全世界的公共卫生造成了巨大的威胁。埃博拉病毒能在旷日持久的疫情中快速分化出不同亚系，在疫情爆发期间实时监测病毒基因组的变化能够为指导防控措施提供高质量的参考信息，但前提是测序数据的产出要足够及时[7]。中国公共卫生团队于塞拉利昂建立了SGS测序平台，在完成疫情防控任务的同时对埃博拉病毒进行基因组监测。但SGS平台较为笨重，需要占用3～4间病房来分区部署全部设备，人力的需求和运输的难度也客观存在。相比之下，Joshua等[8]基于MinION设计了一整套测序系统，所有设备都能打包到常规大小的航空行李中送往几内亚疫区，一张普通的实验台即可摆放3台手掌大小的MinION测序仪和配套笔记本电脑，MinION同样在利比里亚被用于埃博拉病毒的测序工作[9]。有时出于政治、伦理或者交通方面的原因，样本无法被运送到条件完备的测序实验室[2]，或者身处诸如坦桑尼亚热带雨林[10]、南极麦克默多干谷[11]和国际空间站[12]这种极端苛刻的工作条件下，MinION具有非常显著的优势。

2.3简单快速MinION的安装就像给电脑外接一块移动硬盘一样方便，且测序速度极快。MinION开始工作后短时间内就有大量的文库DNA链穿过纳米孔并造成电流变化，电信号以极快的速度输入电脑。当电脑的硬件配置较低时，碱基识别的速度甚至会赶不上测序速度，以至于MinION停止运行后电脑还要继续处理原始数据。相对于Sanger法或SGS平台，MinION单条read的准确性较低[13]，但是较快的测序速度能够在某种程度上弥补这一不足。本研究团队基于MinION建立了针对肠道病毒的纳米孔测序方法，利用重叠的扩增子进行全基因组测序，在6 h内平均每分钟可以获得约3 000条reads[14]。在针对肠道病毒71型毒株的单样本检测中，MinION测序开始后的第一分钟内所产生的数据即可达到与Sanger法结果98.5%的一致性，在14 min内可达到99%的一致性。在这样短的时间内，通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定同等大小(2～3.8 Kb)的PCR产物都不可能实现，MinION使得高通量测序变得像实验室里最简单的基础实验一样便捷。

3 病毒基因组测序策略中的应用优势

目前病毒基因组测序策略主要有3种：PCR扩增子测序，宏基因组测序和杂交靶向富集测序。PCR扩增子测序适用于短基因组病毒并且引物结合位点多样性较低；宏基因组测序最适合对未知病毒进行诊断性测序；靶向富集则对所有大小的病原体均适用，且单管化的样本制备过程使其具有自动化的潜力[15]。

3.1PCR扩增子测序基于特异性引物的PCR是最常见的模板富集方法，对于基因组较小的病毒而言，仅仅几次PCR扩增就可组装出整个基因组，比如流感病毒。早年间基于Sanger法和SGS平台的全基因组测序对流感病毒的研究起到了极大的推动作用[16-17]，类似的方案在MinION上也得以实现[18]。研究发现，与Sanger法和Illumina MiSeq方法相比，由MinION生成的基因组间核苷酸差异是最小的；MinION运行4 h所产生的数据量，足以生成可靠的基因组序列。在流感大流行期间，研究者可以在现场分析样品，并对亚型、重配、致病性和抗病毒药物敏感性等特点做出初步判断。

扩增子测序的特异性和灵敏度都很高，适用于区分同源性较高的毒株或低浓度临床样本。基于MinION的扩增子测序能准确地对同源性超过98%的痘病毒(牛痘、改良型痘苗病毒安卡拉株、痘苗病毒李斯特株)实现毒株水平的鉴定[13]。为了降低高错误率所带来的影响，研究者认为reads与正确物种(株)的比对速率必须远高于会导致假阳性的错误比对的速率。即使利用Barcode在一次运行中对10株柯萨奇病毒A16型全基因组同时测序[14]，第1 min即可达到平均96.11% (94.12%～97.33%) 的准确性，在17 min内可达到99%的准确性，足以实现不同毒株的区分与鉴定。多重PCR技术与MinION的结合使人们可以从<50个拷贝/反应的样品中靶向富集病毒基因组，继而在1～2 d内从临床样本中获得病毒共有序列[19]。这套方案包括在线引物设计工具、新型多重PCR富集方法、文库制备方法以及用于生成共有序列的生物信息学流程。已经被几个研究Zika病毒进化的团队成功应用，并且用于研究Zika病毒在美洲的传播特征[20-21]，也可用于对其他RNA或DNA病毒基因组的测序。

然而扩增子测序的缺陷也很明显，引物设计需要对病毒基因组有先验知识，所以该方法对新病毒的检测能力十分有限。即使是针对已知病毒，PCR条件优化对于扩增子测序的影响非常大，引物结合位点高变，基因组多样性以及复杂的基因组结构都会影响PCR的成功率和扩增效率。如果待测病毒的基因组很大(如痘病毒和冠状病毒)，扩增子测序很耗费模板核酸，而且工作量和污染风险都会增加。

3.2宏基因组测序宏基因组学方法已被广泛用于病原体的发现和对环境以及临床样本中微生物多样性的特性描述。宏基因组学从样品中提取包括宿主、细菌、病毒、真菌和其他病原体在内的总DNA和/或RNA，构建测序文库然后由鸟枪测序法或RNA测序法(RNA-seq)对其测序。该方法无需设计引物或探针，能迅速应对不明原因感染的病例或作为发现新病毒的策略。利用MinION对委内瑞拉马脑炎病毒实施宏基因组测序仅用3 h即可实现毒株水平的鉴定，同样的方法也能快速检测出埃博拉病毒，但这两次测序所使用的毒株都预先经过了培养[22]，不能充分证明MinION适用于临床上不明原因感染的诊断。Greaninger 等[23]直接对临床血液样本实施宏基因组测序，从样本处理到结果产出所需周转时间不超过6 h。但值得注意的是，该研究中所检测的基孔肯雅病毒、埃博拉病毒和丙型肝炎病毒的滴度高达每毫升105～108拷贝，这表明MinION对低浓度临床样本的宏基因组测序性能仍有待评估。除了临床样本或者病毒培养物，MinION也可对蚊虫体内的病毒进行宏基因组测序[24]。该次测序共产出82 259条reads, 其中目的病原体罗斯河病毒的reads有229条，占总数据量0.28%。在这0.28%的数据中，12%产生于前10 min，32.3%产生于前1 h，87.3%产生于前10 h。这表明通过实时数据分析，可以在极短的时间内获得初步的病毒检测结果。

相对于扩增子测序，样本中的病毒载量对宏基因组测序中的病毒基因组覆盖度有很大影响。由于未经过富集，高比例的非目的reads会降低对靶向病原体的检测灵敏度，并且会增加生物信息学分析的难度[15]。除了技术上的不足，宏基因组测序会带来一系列伦理问题[25]。对临床样本直接进行测序可能会有意外的发现，即使这些结果与科研目的无关，对于患者而言可能非常重要。比如检测到目的病原体的同时发现了HIV感染，需要谨慎地考虑如何复核结果以及是否告知患者及其家属。另外，宏基因组数据经常含有大量的宿主基因组序列，将其发布在公开的数据库中涉及到患者的隐私问题，这需要伦理道德委员会制定科学合理的指导方针[26]。

3.3杂交靶向富集测序在测序之前通过DNA杂交可以富集到复杂样本中的目标DNA分子或减少非目标DNA分子，比宏基因组测序提高了特异性，较扩增子测序减少了PCR所引入的突变(无需扩增或少量扩增)，从而更准确地反映病毒基因组的体内突变频率。先前针对高通量测序平台的富集方案仅能捕获约200～300 nt的短片段，可能会丢失重要的结构信息，如病毒或细菌中常见的重组或易位。Eckert等[27]改进了已有的富集方法，选择性地富集特定细菌和病毒的DNA/cDNA大片段用于MinION测序。数据分析发现，由于培养物的基因组背景太高，未经富集的病毒样本中没有检测到与相应病毒匹配的reads。相比之下，富集过的流感病毒与人巨细胞病毒样本分别有57%和99%的高质量的匹配reads。

靶向富集法需要设计探针，它不同于PCR扩增法只需知道靶向区域两侧的序列，而需对该区域内部的序列也有所了解，需要较强的专业技术背景。虽然利用探针之间的重叠序列可能会提高捕获目的片段的概率[28]，靶向富集法在检测新病毒方面仍存在诸多挑战，而针对病毒组的捕获测序法[29]不失为一种合理的设计思路。探针的合成与修饰比较昂贵，而且后续的杂交时间长达16 h[27]。综合考虑时间与经济成本，在达到同样灵敏度和覆盖度的情况下，扩增子测序与靶向富集测序哪一种更适用于对已知病毒的研究需要进一步探索。

4 思考与展望

从单分子测序的角度，MinION与Pacbio一样属于第三代测序(Third-Generation Sequencing，TGS)平台。但是相比于以往的测序技术，纳米孔测序的技术原理是具有颠覆性的，有些学者将其定描述为第四代测序技术(Fourth-Generation Sequencing，FGS)[1,30]。然而FGS在某些文献中也同时指代固态纳米孔测序技术[1]，或者特指原位测序技术[31]，这都有别于MinION采用的生物纳米孔测序技术。随着不同学科在生物学领域中相互交叉、融合与渗透，新型测序技术将会不断涌现，单纯以高通量测序、单分子测序、TGS或FGS这种宽泛的概念来指代某种特定技术可能会引起歧义，这需要在表述时更加严谨。

相对于真核生物或细菌基因组，病毒基因组测序中存在其特有的挑战，其中某些难点有望通过纳米孔测序技术解决。RNA病毒的基因组以往必须通过逆转录与二链合成才能进行测序，从而不可避免地引入偏差。MinION可以直接对RNA进行测序，这有助于研究RNA病毒基因组以及核糖体RNA[32-33]，目前的方案要求RNA的样本量达到500 ng且具有3′polyA结构，而且其测序准确度还有待进一步提高。还有很多难点是纳米孔测序尚不能解决的，比如不同病毒门之间缺少保守的同源性基因，难以设计通用引物(类似于细菌16 s rRNA)用于广泛的病毒组学研究[15]。无论样品是来自于病原体培养还是直接来自于临床标本，对病毒基因组测序均会因宿主DNA的污染而变得复杂[34]。这种污染无法利用甲基化来去除，因为DNA病毒通常在宿主细胞内被甲基化，其修饰方式与宿主类似[15]，这一点不同于细菌基因组基于甲基化的靶向富集[35]。尽管MinION可以检测DNA的甲基化[36](Pacbio平台也可以[37])，但这通常用于研究细胞的表观遗传学，与病毒基因组的靶向富集没有太大关系。

除了用于诊断目的，病毒基因组测序还可用于耐药性检测，有些病毒的基因组较大[40]，或者耐药基因散布在整个基因组中[41]，针对单耐药基因检测的时间和经济成本的无明显优势，全基因组测序是更合理的策略。目前利用纳米孔测序技术专门检测病毒耐药的研究并不多[6]，但相信随着该技术的推广普及，结合其经济便携的特点，纳米孔测序可以对病毒感染者的个性化医疗起到一定的促进作用。

未来的纳米孔测序将会向着通量更高、便携性更强、自动化程度更高的方向发展。高通量纳米孔测序仪GridION X5本身即是一台高性能的主机，可以装载5个512通道的Flow Cell。而更高通量的PromethION最多可装载48个3 000通道的Flow Cell，这足以满足大规模商业化测序服务的需求。目前MinION的建库过程已经足够简单，但ONT仍致力于开发自动化微流控设备(VolTRAX)来简化实验流程并使文库的质量更加稳定。它另一方面，更为小巧轻便的SmidgION测序仪也正在开发，它以类似配件的形式连接在手机上，将测序仪的便携性推上了新的高度[3]。

纳米孔测序技术将在病毒基因组的研究中扮演越来越重要的角色，甚至可能成为大多数分子生物学或微生物学实验室的标准配置。然而这并不意味着纳米孔测序短时间内能够彻底取代成熟的Sanger测序、SGS或者Pacbio。希望测序平台之间良性的竞争有助于推动创新，提高设备性能并降低价格。同时，应该根据具体的科研目的和临床需求构建适宜的测序方案，善加利用不同方法的技术优势以弥补彼此的缺陷，从而实现新的病毒学发现。

利益冲突:无

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