绞股蓝茶皂苷对高胆碱饮食所致小鼠血管内皮损伤的保护作用

郭建军， 任道远， 李 照

（陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安710119）

美国S.L.Hazen研究组相继出版在Nature（2011）、Nature Medicine （2013） 和 New England Journal of Medicine（2013）杂志上的惊人研究发现[1-3]，人体必需营养素L-肉碱、胆碱或卵磷脂在肠道内被肠生理菌群代谢为三甲胺TMA，而进入体循环的TMA进一步由肝脏黄素单加氧酶FMO-3代谢转化为氧化三甲胺TMAO，而血循环TMAO介导血管动脉粥样硬化的发生，从而引发各种心血管疾病（如图1所示）。因此，除作为机体必须营养素外，胆碱还是一种潜在的食品有害成分。正确认识胆碱的生物作用及深入研究胆碱对血管内皮损伤的机理，对干预其危害和构建合理的胆碱膳食指南具有重要的科学意义。近年来，饮食介导调节各种心血管疾病越来越引起人们的关注。研究表明食物中的植物素具有一定的血管保护作用，比如多糖，黄酮类，皂苷等[4-6]。

图1 胆碱在机体内代谢通路Fig.1 Choline metabolic pathways in body

绞股蓝，属于葫芦科的一种多年生藤本植物，是一种知名的药食两用的植物，通常也被加工成一种草本茶，即绞股蓝茶[7-8]。和绿茶一样，绞股蓝茶也具有多种健康功效，像抗氧化性，抗癌活性，调节血压，增强免疫，降低胆固醇等[7-9]。绞股蓝皂苷（Gypenosides）是绞股蓝全草的有效成分，具有显著降血脂、抗缺氧、抗衰老、提高免疫功能等多种功能[10-11]。绞股蓝茶皂苷作为主要的活性物质，近年来用来预防和治疗新陈代谢的和心血管疾病[12-13]。

因此，我们选择饮食氯化胆碱作为胆碱来源，在前期实验的基础上，继续深入探究高剂量饮食氯化胆碱对小鼠的血管内皮的损伤情况，并用天然提取药物绞股蓝茶皂苷干预，以期达到预防和改善血管内皮细胞损伤，从而达到食源性药物预防和改善心血管疾病。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 动物 实验昆明小鼠（体重（18±2）g），动物许可证XJYYLL-2015689，由第四军医大学提供。

1.1.2 药物试剂和仪器 绞股蓝茶：平利县兴强富硒茶叶有限公司产品；食用胆碱：济南亚西亚药业有限公司产品；一氧化氮合酶 （eNOS）、一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）、血栓素（TXA2）、前列腺素（PGI2）：南京建成生物公司提供；伊红、苏木素：西安医科生物产品；MILLI-Q超纯水仪：美国MILLIPORE公司产品；F6/10-10G匀浆机：上海弗鲁克设备有限公司产品；Megafuge1.0R冷冻离心机：美国Thermo公司产品；AL104电子天平：MettlerToledo公司产品；手术器械等：广东医疗器械厂产品。

1.2 实验方法

1.2.1 绞股蓝茶总皂苷的制备 绞股蓝茶总皂苷样品的制备参照先前的实验获得[7]。

1.2.2 动物实验的设计 实验昆明小鼠随机分组5组（10 只/组），即：正常组（Normal）、模型组（Model）、绞股蓝茶皂苷药物低、中、高3个剂量组（200、400 mg/kg和800 mg/kg）。其中，Normal组动物给予平常实验用的鼠粮和自来水，Model和绞股蓝茶皂苷干预组都给予质量分数为3%的胆碱水溶液代替普通的饮水进行饲喂。绞股蓝茶皂苷营养干预组小鼠每天每一只按照不同浓度茶皂苷进行灌胃（0.4 mL/只）。Normal和Model给予0.4 mL/只质量分数为0.9%氯化钠溶液。所有小鼠在适宜条件下饲养2个月，在处理前一天，小鼠采取禁食但不禁水的12 h后，腹腔注射戊巴比妥钠（50 mL/kg）使小鼠昏迷，通过眼眶静脉丛取血法采集血液，并迅速离心取上清液（4 000 g，20 min），于-80 ℃保存以备后续测定[14]。 取小鼠胸主动脉血管约2 cm于质量分数为4%的多聚甲醛固定，于4℃保存以备后续组织病理学分析。

1.2.3 动物血清生化指标的测定 反映血管内皮功能的指标，一氧化氮合酶 （eNOS）、一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）、血栓素（TXA2）、前列腺素（PGI2）通过试剂盒说明进行测定。

1.2.4 动物组织病理学分析 将固定于质量分数为4%多聚甲醛的小鼠胸主动脉血管用石蜡固定后用切片机切成5～6 μm的厚度进行H&E染色分析[15]。

1.2.5 统计学分析 所有测试指标均进行3次重复后取平均数，试验结果用mean±SD（标准差）来表示，用DPS统计学软件对得到的结果进行显著性的分析和单因素的方差分析。显著性差异（p＜0.05），极显著性差异（p＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 绞股蓝茶总皂苷的制备

绞股蓝茶总皂苷经工艺优化提取，D101大孔吸附树脂纯化后，采用香草醛-高氯酸比色法测定其质量分数为83%[7]。

2.2 绞股蓝茶皂苷对血清eNOS，NO和ET-1水平的影响

NO与ET-1可以协调控制血管的张力，NO可以扩展血管，活化血小板、抑制血小板凝聚，以及抗炎症反应得等功能，而NO由eNOS催化合成的[16-17]。ET-1具有强烈的收缩血管的作用，损伤的血管内皮细胞可释放大量ET，可损伤血管和心肌组织[18]。

如图2所示，小鼠血清中的eNOS活性和NO水平显著降低 （p＜0.01），ET-1水平显著升高 （p＜0.01）。与正常组相比，模型组小鼠eNOS活性和NO水平分别降低了 25.9%（p＜0.01，图 2（a））和 59.0%（p＜0.01，图 2（b）），而 ET-1 水平升高了 32.0%（p＜0.01，图 2（c））。 通过药物绞股蓝茶皂苷（400 mg/kg和 800 mg/kg）营养干预后，eNOS活性和NO水平的降低以及ET-1水平的升高可以得到显著性抑制（p＜0.05，p＜0.01），而 200 mg/（kg·bw）干预的 eNOS活性和ET-1水平没有显著性的变化（p＞0.05）。

图2 血清中内皮细胞分泌物水平变化Fig.2 Serum levels of substances generated by endothelial cells

2.3 绞股蓝茶皂苷对血清TXA2和PGI2水平的影响

血栓素 A2（TXA2）和前列环素（PGI2）也是由血管内细胞分泌的，它们通过在血管中改变血管的舒张和收缩来体现VEC的功能。它们的比值（TXA2/PGI2）大小能反应血管功能是否正常。当TXA2水平升高而PGI2降低则证明体内的血管内细胞功能损伤。也许会进一步引起动脉粥样硬化病变[19-20]。

图3 血清中内皮细胞分泌物水平变化Fig.3 Serum levels of substances generated by endothelial cells

如图3所示，小鼠血清中TXA2的水平从（121.0±15.1） pg/mL 升高到（546.8±47.8） pg/mL（p＜0.01，图 3（a）），而 PGI2的水平从（50.7±5.2） pg/mL降低到（19.4±3.4）pg/mL（p＜0.01，图 3（b））。 通过药物绞股蓝茶皂苷营养干预后，在绞股蓝茶皂苷200 mg/（kg·bw） 处理组，TXA2的水平降到了 （211.5±34.8）pg/mL，而在处理400 mg/kg和 800 mg/kg组，TXA2的水平以剂量依赖型的得到改善。而PGI2的水平在400 mg/kg营养干预后，PGI2的水平上升到（24.3±4.3） pg/mL（p＜0.05），处理 800 mg/kg 剂量可以显著性地提高 PGI2的水平（p＜0.01）。

2.4 小鼠胸主动脉的组织病理学观察

内皮组织的完整性可以调节血管内环境的稳定，当遇到物理或化学的损坏时，内皮细胞将表现出不正常的功能，伴随一系列的临床症状和心血管疾病[21-23]。

图4 小鼠胸主动脉H&E染色以及内膜中膜与内腔的厚度比例Fig.4 Thoracic aortas stained by H&E and intimamedia/lumenratio of the thoracic aorta

如图4（a）所示，与正常组相比，模型组小鼠的胸主动脉血管壁的内皮组织发生了形态变化，表现为明显的血管壁增生，血管中膜的增厚等。然而，绞股蓝茶皂苷剂量营养干预后小鼠的胸主动脉血管壁的内皮组织逐渐恢复到原来的组织形态。图4（b）呈现了血管内膜中膜与内腔的比例，从柱形图可以看出药物绞股蓝茶皂苷可以减少饮食胆碱导致的壁厚率。与正常组相比，模型组血管内膜中膜与内腔的比例增加了91.1%，而通过茶皂苷营养干预后，200、400 mg/kg和 800 mg/kg组与模型组相比分别降低了 5.5%（p＞0.05）、14.3%（p＜0.05） 和 30.0%（p＜0.01）。以上结果表明，药物绞股蓝茶皂苷可以改善饮食胆碱所造成的血管功能异常。

3 结 语

胆碱通常作为一种必需的营养补充剂，而且有研究报道称缺乏饮食胆碱可能导致非酒精性肝损伤和肌肉损伤[2，24]。然而Wang等[1]的报道饮食胆碱与心血管疾病的发生密切相关，这引起了人们的普遍关注。饮食胆碱可以诱导小鼠各种心血管疾病除美国S.L.Hazen研究组的研究报道后再无追踪到其它研究报道，因此作者通过近3年的追踪研究，预实验已经初步验证了高剂量饮食氯化胆碱摄入能够诱发小鼠血管内皮损伤的事实后，作者选用高剂量饮食氯化胆碱造模，诱发小鼠血管内皮损伤模型，并寻求天然药物进行营养干预。绞股蓝皂苷作为一种草本植物的提取物在降血脂、降血糖、平衡血压、抗缺氧、抗衰老、促进细胞新陈代谢、提高免疫功能、肝保护等方面已有研究报道[10-11]。绞股蓝茶是将收割后的绞股蓝茎或叶，经过净制、蒸制、炒制、揉制、烘制、包装等工艺加工而成的饮用茶[7]。本研究中选取绞股蓝茶皂苷作为药物营养干预高饮食胆碱所致的小鼠血管内皮细胞损伤。通过检测反映血管内皮细胞功能指标 eNOS、NO、PGI2、ET-1、TXA2以及胸主动脉内皮细胞的组织切片，我们发现又一次证实了高饮食胆碱可以导致血管内皮细胞功能异常，并且茶皂苷营养干预可以明显改善血管内皮细胞功能的异常。

因此，本研究的结果可以为人们对饮食胆碱的认识进一步提高理论依据和参考价值，并开启一种可能开发绞股蓝茶皂苷作为一种天然药物或一种潜在的食物补充剂来预防和治疗心血管疾病。

[1]WANG Z，KLIPFELL E，BENNETT B J，et al.Gut flora metabolism of phosphatidyl-choline promotes cardiovascular disease[J].Nature，2011，472（7341）：57-63.

[2]KOETH R A，WANG Z，LEVISON B S，et al.Intestinal microbiota metabolism of L-carnitine，a nutrient in red meat，promotes atherosclerosis[J].Nature Medicine，2013，19（5）：576-585.

[3]TANG W H W，WANG Z，LEVISON B S，et al.Intestinal microbial metabolism of phosphatidylcholine and cardiovascular risk[J].New England Journal of Medicine，2013，368(17)：1575-1584.

[4]WANG Jingfeng，PANG Long，XUE Yong，et al.Protective effects of polysaccharides，triterpene glycosides and collagen polypeptides from Apostichopus japonicus on vascular endothelial cells[J].Chinese Pharmacological Bulletin，2008，24（2）：227-232.（in Chinese）

[5]LIU Aiqun，XIE Lu，LONG Jinglun.Effects of polysaccharide oflaminaria on expression and secretion of t-PA and PAI-1[J].Chinese Journal Public Health，2008，24（3）：334-336.（in Chinese）

[6]HODGSON J M，CROFT K D.Dietary flavonoids：effects on endothelialfunction and blood pressure[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2006，86(15)：2492-2498.

[7]GUO Jianjun，LEI Xiao，RED Daoyuan，et al.Study on purification and antioxidant activity of total saponins of gynostemmatea[J].Science and Technology of Food Industry，2015，36（5）：99-102，107.（in Chinese）

[8]WU P K，TAI W C S，CHOI R C Y，et al.Chemical and DNA authentication of taste variants of Gynostemma pentaphyllum herbal tea[J].Food Chemistry，2011，128(1)：70-80.

[9]BAI M S，GAO J M，FAN C，et al.Bioactive dammarane-type triterpenoids derived from the acid hydrolysate of Gynostemma pentaphyllum saponins[J].Food Chemistry，2010，119(1)：306-310.

[10]SHEN Hongwei，XIAO Yanchun，CHE Renguo，et al.Extraction and content determination of the total gypenosides in Gynostemma pentaphyllum[J].Food Science and Technology，2004（4）：158-160.（in Chinese）

[11]ZHANG Yusong.Health benefits of Gynostemma pentaphyllum tea[J].Agricultural Archaeology，2003 （4）：200-201.（in Chinese）

[12]YAN J，WU Z L，ZHAO Y L，et al.Separation of tea saponin by two-stage foam fractionation[J].Separation and Purification Technology，2011，80(2)：300-305.

[13]CHEOK C Y，SALMAN H A K，SULAIMAN R.Extraction and quantification of saponins：A review[J].Food Research International，2014，59(4)：16-40.

[14]ZHANG R J，ZHAO Y，SUN Y F，et al.Isolation，characterization，and hepatoprotective effects of the raffinose family oligosaccharidesfrom Rehmannia grutinosa Libosch[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61(32)：7786-7793.

[15]GUO J J，MENG Y H，ZHAO Y，et al.Myricetin derived from Hovenia dulcis Thunb.ameliorates vascular endothelial dysfunction and liver injury in high choline-fed mice[J].Food&Function，2015，6(5)：1620-1634.

[16]NING Yaxian，WANG Jianqin，WANG Xueting，et al.The effeet of astragaluscalycosin monomer to TNF-α induced human umbilical vein endothelial cells ET-1/NO[J].Enternational Journal ofUrology and Nephrology，2012，32 （2）：172-176.（in Chinese）

[17]EDIRISINGHE I，BANASZEWSKI K，CAPPOZZO J，et al.Effect of black currant Anthocyanins on the activation of endothelial nitric oxide synthase（eNOS） in vitro in human endothelial cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61(4)：8616-8624.

[18]XUE Jianfeng，ZHAO Chengjun，JIA Ruyi.Injury markers of blood vessel endothelium[J].Medical Recapitulate，2006，12（8）：461-463.（in Chinese）

[19]LIN Rong，LIU Juntian，LI Xu.Protective effect of tetramethylpyrazine on vascular endothelialcell injured byhydrogen peroxide[J].Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology，2000，14（6）：425-429.（in Chinese）

[20]HAO Hongjun，JIN Haiqiang，SUN Weiping，et al.The dynamic analysis of the level of plasma TXB2 and 6-keto-PGF1α in acute cerebrovascular disease[J].Chinese Journal of Laboratory Diagnosis，2012，16（9）：1612-1615.（in Chinese）

[21]POREDOS P.Endothelial dysfunction in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Clinical and Applied Thrombosis-Hemostasis，2002，15(6)：367-368.

[22]SITIA S，TOMASONI L，ATZENI F，et al.From endothelial dysfunction to atherosclerosis[J].Autoimmunity Reviews，2010，9(2)：830-834.

[23]RUSSO G，LEOPOLD J A，LOSCALZO J.Vasoactive substances：nitric oxide and endothelial dysfunction in atherosclerosis[J].Vascular Pharmacology，2002，38(5)：259-269.

[24]HUNT P S，JACOBSON S E，KIM S.Supplemental choline does not attenuate the effects of neonatal ethanol administration on habituation of the heart rate orienting response in rats[J].Neurotoxicology and Teratology，2014，44：121-125.