SERS技术应用于食品中罗丹明B的快速检测

, ,,怀志,*

(1.厦门华厦学院检验科学与技术系,福建厦门 361024; 2.厦门大学萨本栋微米纳米科学技术研究院,福建厦门 361005; 3.厦门市普识纳米科技有限公司,福建厦门 361005)

食品安全已成为全民共同关注的主要问题,完善的样品处理及检测技术可以帮助我们及时发现食品安全中存在的问题。目前,针对不同样品缺乏最佳的处理及检测方式,使得对所检样品准确、可靠的监测和控制不能完全实现。因此,开发出准确、便捷的食品样品处理和检测技术对保障食品安全意义重大[1-2]。

罗丹明B(Rhodamine B,RB)是一种人工合成的三苯甲烷类碱性染料,曾经用作食品添加剂,根据国际癌症研究署(IARC)化学品致癌风险评价实验证明RB具有潜在的毒性和致癌性[3],目前我国和欧盟等都严禁在食品中添加,是近些年来食品中重点监测的非法添加剂[4]。但因其具有色泽鲜艳[5]、着色稳定[6]、价格低廉[7]等特点,常被一些不法商家非法用作食品着色剂(以辣椒制品为主),严重危害了消费者的健康。目前,在中国还没有关于罗丹明B检测的国家标准,也没有快速检测标准,只有进出口食品中罗丹明B的检测标准[8]。主要检测方法是提取后经凝胶色谱净化,再用HPLC和HPLC-MS联用法进行检测[8]。该处理系统价格昂贵,过程繁琐,应用设备多,所需有机溶剂复杂,且检测时间长,很难普及,更不适用于现场快速检测。在快速检测方面,有根据固相萃取原理开发出来的快速检测法[9-10],但该法主要是根据肉眼观察固相萃取柱上的红色条带进行判断,易出现假阳性,准确度低,检测灵敏度也不高。

激光技术的出现使拉曼光谱检测方式在分析化学等很多领域中得到了很好的发展和应用。表面增强拉曼光谱(SERS)是近年来发展起来的一项高灵敏度振动光谱检测技术,借助于纳米金属基底的表面等离激元诱导的表面电磁场的增强效应,SERS可将待测物的信号放大6～10个数量级[11-12],在食品科学和材料科学等领域已经得到了广泛应用[13-14]。

本实验提出了一种以纳米金溶胶为拉曼信号增强模块,结合SERS快速分析的特点,利用自制的样品前处理仪与便携式拉曼光谱检测仪,实现对辣椒制品、腊肉、果汁、葡萄酒等食品中罗丹明B的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

散装辣椒粉、海堤特级辣椒酱、海堤泰式甜辣酱、爱之味酸辣酱和坛坛乡精制剁椒酱,实验编码为L0～L4；广东风味腊肠和天锣香肠,实验编码为R1、R2；果缤纷、贝奇野菜以及长城干红葡萄酒,实验编码为G1～G3；以上材料均购自厦门生鲜超市；氯金酸(HAuCl4)、柠檬酸钠、正己烷等实验中所用试剂 分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司;罗丹明B标准品 上海国药集团化学试剂有限公司;水溶液皆用超纯水(Millipore)配制;金纳米粒子(自制);pers-A1增强助剂 厦门市普识纳米科技公司。

自制SERS前处理仪 与厦门市普识纳米科技公司合作研发),如图1所示:仪器由超声池、挥发池、离心装置以及控制系统构成。挥发池同时具有加热挥发和抽气挥发两种功能,即可以提高挥发度,又能通过抽气方式增加空气流动,对挥发出来的萃取剂进行迅速抽离;自带离心装置,可以现场对少量样品进行快速离心;控制系统可以实现对超声时间、抽气时间、加热温度等的控制；便携式拉曼光谱仪 美国Dalt Nu公司;HITACHI S-4800型扫描电镜 Hitachi公司;Waters 2695E液相色谱仪(带荧光检测器) 美国Waters 公司;UV-3600紫外可见分光光度计 日本岛津公司。

图1 自制SERS前处理仪Fig.1 Appearance of the homemade SERS

1.2 金纳米溶胶的制备及表征

利用柠檬酸钠还原HAuCl4的方法[15]合成金纳米溶胶。制备过程如下:将1.2 mL质量分数为1.0%的柠檬酸钠迅速加入到含有1 mmol/L HAuCl4的100 mL沸水溶液中,同时剧烈搅40 min,得到棕红色纳米金溶胶。取两份适量金溶胶,一份进行紫外可见光谱(UV/Vis)分析，扫描延长为400～800 nm;另一份在5500 r/min室温条件下离心分离10 min,弃去上清液至剩余约5 μL左右的浓缩金纳米粒子,后用超纯水稀释10倍,用移液枪移取5 μL滴加在准备好的硅片上,真空抽干,进行电镜(SEM)扫描。

1.3 罗丹明B标准溶液配制

准确称取罗丹明B标准品适量,加入无水乙醇溶解,配成质量浓度为100 μg/mL的标准储备液。再分别准确量取适量储备液,用水稀释成所需浓度的标准溶液。

1.4 样品前处理及罗丹明B的提取

1.4.1 辣椒粉及其相关制品类固体调味品的前处理方法 分别称取1.0 g海堤特级辣椒酱、海堤泰式甜辣酱、爱之味酸辣酱和坛坛乡精制剁椒酱于提取剂瓶中,加入10 mL超纯水,放置于便携式快速前处理仪超声处理模块,超声频率40 kHz,功率为60 W,超声振荡1 min,取上清液于分离管中,平行三份,依据检测要求分别加入0.5、1.0 mg/kg的罗丹明B标准溶液,之后向溶液中加入4 mL的正己烷进行萃取,将分离管放置于便携式快速前处理仪挥发模块进行加热吹干,待测。

1.4.2 肉制品的前处理方法 由于在肉制品中,色素主要吸附于肉制品的纤维中,利用水进行提取,提取效率低,故采用正己烷作为提取剂,其余操作条件同1.4.1。分别取1.0 g广东风味腊肠和天锣香肠样品,经超声提取后,上清液置于分离管中,平行三份,依据检测要求分别加入0.5、1.0 mg/kg的罗丹明B标准溶液,放置于便携式快速前处理仪挥发模块进行加热吹干后待测。

1.4.3 果汁、葡萄酒等液体样品的前处理方法 分别量取4 mL果缤纷、贝奇野菜以及长城干红葡萄酒于分离管中,加入8 mL正己烷萃取,平行三份,依据检测要求分别加入0.5、1.0 mg/kg的罗丹明B标准溶液,将分离管放置于便携式快速前处理仪挥发模块进行加热吹干后待测。

1.4.4 前处理方法对比 为了验证自制快速处理仪器的提取性能,本实验也进行了自制前处理仪与常规样品处理方法的对比。其中,实验室常规提取方法的具体流程[16-17]为:

称取1.0 g样品→经超声提取(30 ℃,10 min)→离心(室温,5500 r/min 5 min)→正己烷萃取(4 min)→静置分层(11 min)→氮吹(10 min)→超纯水重新溶解(0.5 mL)→即得到提取液。

1.5 拉曼光谱分析

取400 μL上述待测样品,加入20 μL金纳米溶胶,再加入20 μL pers-A1增强助剂,混匀后迅速在便携式拉曼光谱仪上进行检测。该仪器的激光波长为785 nm,激光功率为60 mW,激发时间少于5 s,扫谱范围为200～1800 cm-1。

1.6 液相色谱分析

取1.4.4所得辣椒粉样品提取液,离心后取上清液过0.45 μm微孔滤膜后,采用液相色谱测定。色谱条件:流动相A:0.1%甲酸乙腈,B:0.1%甲酸溶液;0 min:A 20%;5.0 min:A 50%;8.0 min:A 50%;8.1 min:A 20%;15 min:A 20%。色谱柱:Symmetry Shield RP 4.6 mm×250 mm,185 μm,流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;检测波长:Ex 550 nm,Em 580 nm;进样体积:5.0 μL。

1.7 数据处理

因为光源输出功率的稳定性、样品不同添加浓度等因素会引起拉曼信号的偏差,影响检测结果的准确性。因此,本实验选择罗丹明B的一个稳定特征峰(1355 cm-1)为内标信号,采用内标法定量。将罗丹明B的另外三个特征峰(620、1510、1645 cm-1)与内标峰比值作为相对强度,以相对强度作为加标不同浓度的罗丹明B溶液的响应值进行归一化计算。

2 结果与分析

2.1 自制金粒子溶胶表征

取适量1.2中自制金纳米溶胶进行UV/Vis和SEM分析,结果如图2所示,从UV/Vis(图2A)图可以看出,在550 nm附近有一个明显的吸收峰对应50 nm左右金纳米粒子的特征吸收峰;而由SEM(图2B)则可以得知合成的金纳米粒子颗粒较为均匀,大小在45～50 nm之间,与紫外可见光谱结果一致。

图2 自制金纳米粒子的紫外-可见吸收光谱及SEM电镜图Fig.2 UV/Vis and SEM diagram of Au colloid 注:A为紫外-可见吸收光谱, B为SEM电镜图(40.0 k×)。

2.2 辣椒粉经常规前处理和快速法处理的SERS结果对比

从图3可以看到,两种处理方法得到的样品在620、1355、1510、1645 cm-1处都出现了罗丹明B的特征拉曼峰。其中,620 cm-1处的拉曼峰对应氧杂蒽环的面内振动模式,1355 cm-1处的拉曼峰对应苯环上的C-C单键的弯曲振动,1510 cm-1处的拉曼峰对应苯环上C-H单键的弯曲振动,而1645 cm-1附近的拉曼峰则对应苯环上的C-C单键的弯曲或C=C双键的伸缩振动模式。两种处理方法对于SERS谱图的影响差异并不明显。另外,用常规方法处理辣椒粉,整个过程需要大约40～45 min,而用自制的快速前处理仪进行样品处理只需要大约10 min,时间上缩短了3/4,大大提高了检测效率。

图3 罗丹明B实验室常规处理方法与快检法SERS对比图Fig.3 SERS spectrum of Rhodamine B with the instrument and the pretreatment methods注:a:自制前处理仪(约10 min);b:常规方法(40～45 min)。

2.3 不同辣椒制品中各种成分的干扰实验

2.3.1 不同辣椒制品中RB的SERS检测 为保证检测结果的有效性,实验同时进行罗丹明B标准品、空白样品和加标样品的对比测定,结果如图4所示。通过对市面上不同品牌的辣椒调味品进行测试发现:未添加标准罗丹明B的辣椒制品(空白样品)的SERS曲线(图4中所有e曲线),在200～1800 cm-1区间内,基本上为无特征信号的背景曲线,说明空白样品中不含RB成分;而对比罗丹明标准品的SERS谱图可以看到,加标0.2 mg/kg浓度的RB后的样品SERS曲线在620、1355、1510、1645 cm-1处出现了罗丹明B的尖锐特征峰,而且随着罗丹明B加标溶液质量浓度的增大,拉曼峰强度也随着增强,说明检测出了罗丹明B的存在。这表明本实验方法能对这些成分复杂多样的辣椒制品中所含痕量罗丹明B进行高灵敏度的快速检测,同时不受不同的样品成分的干扰。本方法对辣椒制品的检测具有普适性,而且检测低限可达到0.2 mg/kg。

图4 不同成分辣椒制品中罗丹明B SERS谱图Fig.4 SERS spectrum of Rhodamine B in chilli products注:L1～L4分别为海堤特级辣椒酱、海堤泰式甜辣酱、爱之味酸辣酱和坛坛乡精制剁椒酱。

2.3.2 SERS和常规液相色谱方法对比实验 为了验证快速检测方法的可行性,实验选取了辣椒粉及其制品经快速前处理仪提取后,进行SERS和常规液相色谱两种方法检测,结果如表1所示。

表1 实际辣椒粉样品及辣椒制品的SERS及LC两种方法检测结果对比Table 1 Determination results of the chilli samples

由表1可以看出,除了散装辣椒粉中含有微量罗丹明B以外,其他辣椒制品中均不含该成分,两种检测结果真实可信且无明显差异,说明本实验方法可用于各种辣椒制品中罗丹明B的现场筛查或实验室预检。

2.4 其他食品中罗丹明B的检测

2.4.1 肉制品中罗丹明B的检测 由于在肉制品中,色素主要吸附于肉制品的纤维中,利用水进行提取,提取效率低,低浓度情况下无法检出,而且在1 mg/kg时信号也比较微弱。因此,本实验直接采用正己烷提取腊肉及其他肉制品中的罗丹明B,结果如图5所示。由图5中可知,未添加标准罗丹明B的肉制品(空白样品)的SERS谱图(d曲线)中,200～1800 cm-1区间内,基本上依然是无特征信号的背景曲线,说明两种肉制品中不含罗丹明B成分;当添加0.5 mg/kg及以上浓度的标准罗丹明B溶液时,SERS谱图在了620、1355、1510、1645 cm-1附近明显出现了罗丹明B的尖锐特征峰,能够轻易地分辨出该腊肉等制品中是否添加了罗丹明B。本实验方法可成功实现对腊肠中罗丹明B的检测,而且最低检测浓度可达0.5 mg/kg。

图5 肉制品中罗丹明B的SERS谱图 Fig.5 SERS spectrum of Rhodamine B in Bacon and its products注:R1、R2分别为广东风味腊肠和天锣香肠。

2.4.2 果汁及葡萄酒中罗丹明B检测 为了验证方法的普适性,实验还对果汁、葡萄酒等进行快速检测。由于SERS具有指纹图谱特点,所以葡萄酒类样品无需任何前处理。以加标0.5、1 mg/kg罗丹明B样品及标准溶液进行对比,结果如图6所示。由图6可以看到,所有d曲线在200～1800 cm-1区间内,空白样品基本为无特征信号的背景曲线,说明这几种果汁、酒品中不含罗丹明B;而加标0.5 mg/kg浓度后的谱图上可以清楚看到在620、1355、1510、1645 cm-1附近出现了罗丹明B的尖锐特征峰,说明检测到RB的存在,而且随着加标溶液质量浓度的增大,强度也随着增强。综上可知,对于含量高于0.5 mg/kg罗丹明B的样品,可以根据拉曼谱图中特征谱峰位置和相对强度确定样品中是否含有罗丹明B成分。

通过上述各种食品中RB的检测实验可以看出,本方法适用于不同品种、不同成分的样品检测,结果准确可靠、方法可行,最低检测浓度可以达到0.5 mg/kg。

2.5 回收率实验

以加标辣椒粉样品中罗丹明B的测定为例,在100、200、300 μg/L 3个添加水平下,采用内标法进行定量,以被测物的特征峰为内标信号,即以罗丹明B在1355 cm-1的特征峰进行归一化计算,添加平均回收率分别为82.4%、87.0%和81.1%,相对标准偏差RSD分别为2.1%、3.0%和2.2%。由此可见,本方法的准确度良好,满足样品快速分析的要求。

3 结论

本实验基于纳米金溶胶表面增强拉曼光谱技术,利用自主研发的拉曼前处理仪和便携式拉曼检测仪实现了对辣椒及其制品,以及其他食品如果汁、葡萄酒中罗丹明B的现场快速检测。样品的分析时间由常规的40～50 min缩短到约10 min,同时达到0.5 mg/kg的最低检出浓度,以RB在1355 cm-1处的特征峰为内标信号进行归一化计算,在100、200、300 μg·L-1三个添加水平下,得到其平均回收率在81.1%～87.0%之间,相对标准偏差RSD在2.1%～3.0%范围内。本检测方法几乎涵盖了行业标准《进出口食品中罗丹明B的检测方法》中主要检测对象,而且样品前处理简单,耗时少,检测结果准确可靠,且仪器设备便携、易操作,可用于食品中罗丹明B的现场筛查或实验室预检,有望弥补国内现有食品行业标准中关于罗丹明B的检测空白。

[1]Sun D f,Wang G X,Qian S S,et al. Review on testing technologies and standards for food safety[J]. China Measurement and Test,2015,41(8):1-7.

[2]Soylak M,Unsal Y E,Yilmaz E,et al. Determination of rhodamine B in soft drink,waste water and lipstick samples after solid phase extraction[J]. Food and Chemical Toxicology,2011,49(8):1796-1803.

[3]尹峰,丁召伟,杨志坚.固相萃取高效液相色谱串联质谱法检测香辛料中罗丹明B[J].色谱,2012,30(7):672-676.

[4]Liang F H,Jin D H,Ma P Y,et al. Rapid Determination of Rhodamine B in Chili Powder by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy[J]. Analytical Letters,2015,48(12):1918-1929.

[5]Oplatowska M,Elliott C T. Development and validation of rapid disequilibrium enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of Methyl Yellow and Rhodamine B dyes in foods[J]. Analyst,2011,136(11):2403-2410.

[6]Lu Q G,Gao W,Du J J,et al. Discovery of Environmental Rhoda-mine B Contamination in Paprika during the Vegetation Process[J]. Agric Food Chem,2012,60(19):4773-4778.

[7]Gupta V,Mohan D,Sharma S,et al. Removal of basic dyes(Rhodamine B and methylene blue)from aqueous solutions using bagasse fly ash[J]. Sep Sci Tech,2000,35(13):2097-2113.

[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. SN/T 2430-2010进出口食品中罗丹明B的检测方法[S].北京:中国标准出版社,2010.

[9]薛昆鹏,金小青,余冲,等.固相萃取-高效液相色谱-荧光法测定辣椒制品中罗丹明 B[J]. 食品安全质量检测学,2016,7(6):2375-2380.

[10]李小燕,李梅,陈其锋,等. 固相萃取-高效液相色谱检测葡萄酒中罗丹明B[J]. 食品科学,2011,32(8):238-243.

[11]Tian Z Q,Ren B,Wu D Y. Surface-enhanced Raman scattering:from noble to transition metals and from rough surfaces to ordered nanostructures[J]. J Phys Chen B,2002,106(37):9463-9483.

[12]Tian Z Q. Surface-enhanced Raman spectroscopy:advancements and applications[J]. J Raman Spectroscopy,2005,36(6/7):466-470.

[13]Li J F,Huang Y F,Ding Y. Shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy[J]. Nature,2010,464(7287):392-395.

[14]Sun C H,Wang M L,Feng Q,et al. Surface-enhanced Raman scattering(SERS)study on Rhodamine B adsorbed on different substrates[J]. Russ J Phys Chem A,2015,89(2):291-296.

[15]FRENS G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature Phys Sci,1973,241:20-22.

[16]Mishra K P,Gogate P R. Intensification of degradation of Rhodamine B using hydrodynamic cavitations in the presence of additives[J]. Separation and Purification Technology,2010,75:385-391.

[17]Oplatowska M,Elliott C T. Development and validation of rapid disequilibrium enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of Methyl Yellow and Rhodamine B dyes in foods[J]. The Analyst,2015,136:2403-2410.