病原菌影响巨噬细胞极化的研究进展①

张焱皓 龙润莹 刘旭恒 刘芊伊 李 茂 罗军敏

(遵义医学院免疫学教研室，贵州省免疫分子应用研究工程中心，遵义563003)

巨噬细胞是固有免疫应答中宿主防御病原菌的第一道防线,巨噬细胞在趋化因子作用下向炎症灶聚集，借助表面模式受体Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)、清道夫受体(Scavenger receptor,SR)等识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMP)有效地吞噬病原菌，发挥清除病原菌的作用。巨噬细胞具有很强的可塑性，在不同病原菌的刺激及所处微环境的影响下表现出不同的功能特点,主要有经典活化的巨噬细胞(Classically activated macrophage,M1)和替代活化的巨噬细胞(Alternatively activated macrophage,M2)两种类型。M1型巨噬细胞具有杀菌作用，可以产生对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的有效抗菌免疫应答。M2型巨噬细胞具有抑炎作用，有利于病原菌的存活与逃逸。由于病原菌感染引起的宿主微环境改变，巨噬细胞也将呈现一个功能状态的动态变化。因此，病原菌可能通过影响宿主巨噬细胞的极化来调控宿主针对病原菌的免疫应答，从而进一步影响感染性疾病的发生发展。本文对近年来常见病原菌影响巨噬细胞极化的研究进展进行综述。

1 巨噬细胞极化概述

1.1M1型巨噬细胞 M1型巨噬细胞主要由脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、干扰素γ(Interferon γ,IFN-γ) 等激活产生，表达高水平的主要组织相容性复合体Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子、CD68、CD80和CD86等。最新研究发现G蛋白偶联受体蛋白Gpr18和Fpr2以及ectoenzyme CD38可作为M1型巨噬细胞的新的表面标志物[1]。激活的M1型巨噬细胞表达大量促炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子α (Tumor necrosis factor α,TNF-α) 、白细胞介素1β(Interleu-kin 1β,IL-1β)、IL-6、IL-12、IL-23等。M1型巨噬细胞具有强大的抗原提呈及吞噬能力，促进Th1免疫应答发挥抗胞内病原菌和抗肿瘤的作用，且高表达诱导型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase, iNOS)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS) 而具有强大的杀伤病原菌能力，在机体的免疫应答中发挥促炎作用，但也会对机体造成损伤。

1.2M2型巨噬细胞 M2型巨噬细胞分泌抗炎症细胞因子IL-10、IL-13、转化生长因子-β(Transfor-ming growth factor-β,TGF-β)等，在组织修复、肿瘤形成和病原菌免疫逃逸过程中发挥作用。M2型巨噬细胞可根据刺激物及功能特点的不同进一步分为M2a、M2b、M2c3种亚型。M2a型巨噬细胞由IL-4和IL-13刺激分化，高表达甘露糖受体(Macrophage mannose receptor,MR或称CD206)、清道夫受体(Scavenger receptor,SR)、精氨酸酶 1(Arginase-1,Arg1)，低表达iNOS，对病原菌的杀伤能力较弱。M2b型巨噬细胞由免疫复合物刺激分化，高表达IL-10而低表达IL-12，促进Th2型免疫应答。M2c型巨噬细胞由IL-10刺激分化，表达穿透素3(Pentraxin3,PTX3)、类几丁质酶3样分子3(Chitinase 3-like 3,Chi3L3 或称 Ym1)，主要发挥组织修复作用。在体外研究的人类巨噬细胞中，c-MYC表达限于M2表型，并且在M0和M1巨噬细胞中几乎不可检测，同时也发现人类巨噬细胞替代分化为M2表型需要c-MYC[2]。

2 病原菌影响巨噬细胞极化

病原菌通过干扰转录因子，非编码RNA以及相关酶类的表达调控巨噬细胞的极化。不同类型极化的巨噬细胞执行不同的免疫学功能。M1型巨噬细胞可激活Th1细胞，发挥重要的抗胞内病原菌的作用。M2型巨噬细胞分泌TGF-β、IL-10等细胞因子引起免疫抑制，促进病原菌的生存与繁殖。

2.1结核分枝杆菌影响巨噬细胞极化 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，其中以肺部感染最多见。结核性肉芽肿是结核病的主要组织学标志之一，在结核性肉芽肿中发现的主要细胞类型为巨噬细胞。MTB通过其相关抗原影响巨噬细胞极化以利于自身的存活。近年来在MTB感染的相关体外实验中发现MTB 热休克蛋白16.3[3]、MTB致病性菌株毒力因子ESAT6[4]和CFP-10[5]可影响巨噬细胞向M2型极化。M1型和M2型的诱导与结核菌的毒力形成反向关系：强毒株H37Rv诱导巨噬细胞向M2型极化，减毒株H37Ra诱导巨噬细胞向M1型极化，两种菌株在与M1型巨噬细胞共培养后菌落形成单位均减少，而在M2型中则相反[3]。

在结核病患者的外周血中已经观察到miR-26a的表达降低[6]。Sahu等[7]发现H37Rv感染巨噬细胞后miR-26a表达下调，Krüppel样因子4(Krüppe-like factor 4,KLF4)和CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein beta,C/EBPβ)转录上调，Arg1活性增加，iNOS的表达受到抑制，诱导巨噬细胞向M2型极化。

有研究发现C/EBPβ在调节巨噬细胞的M1/M2表型中起着核心作用[7]。它与核转录因子-κB(NF-κB)结合，诱导巨噬细胞向M1极化并释放促炎细胞因子，而与STAT6结合则将巨噬细胞导向M2极化，并产生抗炎细胞因子和M2型特异性表面标记[8]。此外，KLF4似乎与C/EBPβ一起协同促进M2分化。用H37Rv感染KLF4和C/EBPβ双敲减的巨噬细胞后，发现两者的同时敲减具有协同抑制精氨酸酶活性的作用[4]。进一步的研究发现KLF4诱导单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白(Monocyte chemotactic protein-induced protein,MCPIP)表达，继而激活C/EBPβ的转录。因此推测MCPIP可能是KLF4和C/EBPβ之间的联系点。由此，KLF4通过该联系点促C/EBPβ表达而达到他们协同促M2分化的作用。

近期研究发现MTB调控的巨噬细胞自噬及凋亡可能与极化相关。在H37Rv感染的巨噬细胞中miR-26a/KLF4/髓样细胞白血病-1(Myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)轴参与调节自噬，敲低KLF4或过表达miR-26a将促进MTB向溶酶体的运输，增加对结核分枝杆菌的杀伤[7]。也就是说抑制KLF4将促进巨噬细胞M1型极化，增加自噬。但也有体外研究表明促进自噬将减少LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的分泌[9]，可能抑制了巨噬细胞M1型极化。因此自噬与巨噬细胞极化之间可能存在相互制约的关系。Lim等[4]用H37Ra感染巨噬细胞，并检测了ATF6、PERK、IREα三条内质网应激通路的相关蛋白，发现相比M2型巨噬细胞，M1型巨噬细胞ATF6、PERK、IRE1α、GRP94、Ero1α高表达，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)、Caspase-12、Caspase-3的表达也出现了上调，表明ER应激介导的凋亡与M1型巨噬细胞极化有关。除此之外，Chen等[10]发现小鼠巨噬细胞在H37Rv感染过后，Wnt5a的减少呈剂量和时间依赖性，MTB诱导的-1β、IL-6和IL-12在小鼠肺组织或BMDM中减弱，巨噬细胞向M2型极化。用分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)沉默Wnt5a，发现巨噬细胞分泌的炎性细胞因子显著减弱，巨噬细胞仍向M2型极化，但却增加了巨噬细胞的凋亡，抑制细菌生长。这似乎表明了巨噬细胞极化与凋亡之间有着复杂的关系，但具体机制仍待阐明。而且Wnt5a在人MTB感染过程中存在相反表达，需要更进一步的研究，模拟出更接近人类感染的模型。因此，在MTB感染中促进自噬，上调内质网应激以及凋亡，并发现极化与自噬、凋亡之间可能的机制将会是结核治疗领域的新突破点。

2.2幽门螺旋杆菌影响巨噬细胞极化 幽门螺旋杆菌为一类定植于胃黏膜表面或胃黏膜层的革兰氏阴性菌，其感染引发的慢性胃炎是消化性溃疡和胃恶性肿瘤发病的主要危险因素。在幽门螺旋杆菌感染期间，巨噬细胞被招募到胃黏膜参与相关免疫应答，影响胃部炎症的发展，决定病原菌的定植。

在感染期间，巨噬细胞可上调缺氧诱导因子1(Hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)的表达从而诱导巨噬细胞极化对抗幽门螺旋杆菌的感染。研究表明缺乏HIF-1的巨噬细胞聚集性、运动能力和杀菌能力减弱[11]。在低氧反应中，相比NF-κB，HIF-1在调控巨噬细胞受体和细胞因子表达中发挥更重要的作用[12]。Matak等[13]发现幽门螺旋杆菌通过HIF-1诱导M1型极化，并且通过HIF-1非依赖性机制阻止巨噬细胞M1表型的转换。该团队用两类极化的巨噬细胞与SS1菌株提取物共培养24 h，发现HIF-1在M1型巨噬细胞mRNA和蛋白质水平上调，但在M2中没有改变。Nos2、IL-1β和IL-6的表达在M1型巨噬细胞与SS1共培养时显著增加，但是在HIF-1缺陷型的巨噬细胞中三种因子的增加变缓，表明这些炎症介质主要由髓样谱系产生并处于HIF-1的控制之下。因此通过诱导剂激活HIF-1可促进骨髓细胞产生炎症因子并提高杀菌能力。但一些病原菌可能会干扰HIF-1活性以改善其存活和增殖。

为阻止巨噬细胞有效的免疫应答机制，幽门螺旋杆菌通过上调精氨酸酶2(Arginase-2,Arg2)和鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase,ODC)等相关酶类参与促进巨噬细胞M1型极化。Hardbower等[14]从WT和Arg2敲除小鼠中分离骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)，并用幽门螺旋杆菌PMSS1菌株与其共培养24 h后，发现巨噬细胞炎症因子分泌增多，幽门螺旋杆菌的定植减少。表明Arg2在促巨噬细胞M2极化中扮演着重要的角色。ODC具有相似的促M2极化作用[15]。幽门螺旋杆菌通过ERK[16]和MYC[17]信号传导上调ODC。ODC作为多胺合成中的限速酶，将L-鸟氨酸转化为多胺。此外，Arg2的缺失也可导致幽门螺旋杆菌感染期间胃多胺合成上调[14]。之前有研究已经证明ODC和所产生的多胺都具有影响组蛋白修饰的能力，可调节基因转录[18,19]。ODC缺陷型巨噬细胞导致H3K9的甲基化减少，直接导致M1相关细胞因子的大量分泌而对幽门螺旋杆菌造成杀伤[15]。因此，幽门螺旋杆菌调控Arg2和ODC的高表达而有利于其创造持续感染的低炎症环境，抑制巨噬细胞对幽门螺旋杆菌的清除。虽然近年来幽门螺旋杆菌影响巨噬细胞极化的研究增多，但极化的机制方面并不明确。深入对极化机制以及多胺代谢的研究将利于控制幽门螺旋杆菌的免疫逃逸，有利于相关治疗药物的研发。

2.3金黄色葡萄球菌影响巨噬细胞极化 金黄色葡萄球菌为一类侵袭性细菌，其产生的毒素对肠道破坏性大，引起的肠炎起病急，中毒症状严重。在感染早期，巨噬细胞可能通过上调Fox01的表达来调控CC趋化因子受体7(CC chemokine receptor 7,CCR7)和CCR2来促进巨噬细胞在肝脏中的聚集和定位，并且Fox01的高表达可上调TLR2介导的巨噬细胞M1型极化，对抗金黄色葡萄球菌的感染[20]。

目前已经有大量研究发现microRNA在金黄色葡萄球菌的感染中能够调控巨噬细胞极化，改变巨噬细胞功能。microRNA 155通过抑制细胞因子信号抑制物1(Suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)的表达促进Akt1缺陷小鼠巨噬细胞中M1标志基因的转录，表现出细菌清除率增强[21]。研究发现受金黄色葡萄球菌刺激的人和小鼠巨噬细胞的miR-24表达均显著降低，miR-24的表达降低增加了M1表型标志物如IL-6、iNOS和TNF-α的产生，促进巨噬细胞的M1型极化[22]。通过生物信息学软件预测并证实壳多糖酶3样蛋白1(Chitinase-3-like protein 1,CHI3L1)基因为miR-24的靶基因，miR-24过表达抑制CHI3L1表达并下调下游的MAPK途径。该途径可作为金黄色葡萄球菌诱导巨噬细胞极化的调节通路，有可能成为金黄色葡萄球菌相关感染和炎症治疗的新靶点。

2.4鼠沙门氏菌影响巨噬细胞极化 鼠伤寒沙门氏菌是一种革兰氏阴性短杆菌，具有复杂的抗原结构，一般可分为菌体(O)抗原，鞭毛(H)抗原和表面(Vi)抗原3种。据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。目前已经有大量的研究表明巨噬细胞可能是机体抗御鼠伤寒沙门氏菌感染的重要细胞。

在肠道感染的早期，鼠伤寒沙门氏菌rfc基因编码的O抗原通过TLR4增强iNOS的分泌并使鼠源性巨噬细胞向M1极化[23]，说明在感染早期巨噬细胞对抗伤寒沙门氏菌能形成有效的免疫应答，而在长期的较量中巨噬细胞可能成为了其避难所。Lathrop等[24]发现伤寒沙门氏菌可以在人单核细胞衍生的M2或M0表型巨噬细胞中增殖，而在M1表型巨噬细胞中没有检测到，说明伤寒沙门氏菌促进巨噬细胞向M2极化以逃避杀伤，但具体机制不明确。

近年的研究发现巨噬细胞铁代谢与鼠伤寒沙门氏菌感染引起的炎症具有相关性。鼠伤寒沙门氏菌sufC基因可影响铁离子的转运,参与细菌对抗宿主巨噬细胞的氧化应激。Wang等[25]发现巨噬细胞在被sufC敲除的鼠伤寒沙门氏菌感染后IL-6和TNF-α的表达降低，表明sufC可能通过铁的代谢促进巨噬细胞向M1极化的作用。脂质运载蛋白2(Lipocalin2,LCN2)是具有多效性的先天免疫肽，具有免疫调节作用，可以结合含铁的细菌铁载体。Nairz等[26]发现在感染鼠伤寒沙门氏菌后LCN2降低巨噬细胞内铁含量，增强促炎细胞因子如Nos2、TNF-α和IL-6的表达，可能促进巨噬细胞向M1极化来增强宿主抗鼠伤寒沙门氏菌感染。对感染者铁代谢的调节可能是今后对抗病原菌的重要策略。

2.5霍乱弧菌影响巨噬细胞极化 人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或食物经口传染。霍乱弧菌侵入小肠后在肠黏膜表面迅速繁殖，在繁殖过程中产生肠毒素而致病。霍乱弧菌感染后，巨噬细胞在小肠黏膜大量聚集，参与对霍乱弧菌的免疫应答。

OmpU是霍乱弧菌的外膜蛋白，具有诱导巨噬细胞产生炎症因子的能力，通过激活TLR1和TLR2诱导巨噬细胞活化[27]。Sakharwade等[28]用OmpU处理LPS活化的M1型巨噬细胞表现出LPS诱导的促炎介质的下调，IL-10表达上调，TLR2/6异二聚体结合的降低，髓样分化因子(Myeloid differentiation factor88,MyD88)和白细胞介素-1受体相关激酶(IL-1 receptor associated kinase,IRAK)-1/4的募集减少，IRAK-M的表达增加，TLR信号转导受到抑制。但是进一步的研究发现虽然该过程降低了促炎效应，但是并不诱导巨噬细M2型极化[29]。所以OmpU可能诱导巨噬细胞形成了介于M1和M2型巨噬细胞之间的中间态以利于其生存。在今后的研究中，寻找在病原菌中类似于OmpU的相关蛋白，明确病原菌对宿主巨噬细胞极化的调控策略，将有利于感染性疾病的治疗。

2.6其他病原菌影响巨噬细胞极化 巨噬细胞在与病原菌相互作用的过程中，受病原菌毒力强弱的影响，相关抗原的干扰或检测时正处于感染某个特殊阶段等原因，巨噬细胞极化的状态可呈现一个动态变化的过程。

研究发现流感嗜血杆菌、痢疾志贺菌、牙龈卟啉单胞菌和粪肠球菌将巨噬细胞极化为M1表型。流感嗜血杆菌通过非受体型酪氨酸磷酸酶-2(SH2-domain-containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP2)依赖的p65-NF-κB信号途径激活宿主巨噬细胞向M1型极化[30]。痢疾志贺菌经消化道感染人体后，可导致肠黏膜炎症、坏死及溃疡。Biswas等[31]用痢疾志贺氏菌1型孔蛋白刺激57BL/6小鼠的腹腔巨噬细胞，检测到孔蛋白诱导巨噬细胞表达TNF-α和IL-12，表现出巨噬细胞向M1型极化。口腔病原体牙龈卟啉单胞菌可导致高炎症环境，可能具有改变巨噬细胞向M1极化的能力[32]。粪肠球菌将结肠巨噬细胞极化为M1型，并且产生导致相邻细胞DNA损伤的“旁观者效应”[33]。

淋病奈瑟氏菌、念珠菌、隐球菌刺激巨噬细胞向M2表型极化。Ortiz等[34]发现淋病奈瑟氏菌刺激巨噬细胞向M2表型极化，其中一些出现了M2b的表面标志物，没有M1型巨噬细胞的表面标志物出现。体外研究表明，念珠菌不仅本身产生，而且还诱导宿主细胞产生前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)[35-37]。Kim等[38]提供了念珠菌通过PGE2将巨噬细胞表型改变为M2型的证据。在体外用新生隐球菌与巨噬细胞共培养24 h无法诱导M1或M2极化，而体内实验发现肺巨噬细胞极化状态从静息到M2极化演变为M1极化，然后回到静息水平[39]。

3 小结与展望

综上所述，病原菌可通过影响巨噬细胞的极化状态来抑制宿主免疫系统，这种调控可以通过病原体来源成分直接获得，也可以通过病原影响宿主产生不同的炎症因子而间接获得。某些病原菌感染下的M1型巨噬细胞不能完全消除病原菌，导致M1型巨噬细胞产生无效的炎症，病原菌因此得以逃避宿主免疫系统的防御和杀伤。目前病原菌影响巨噬细胞极化的相关试验大部分是体外实验，所用的细胞株也有不同，而体外实验和动物体内实验也有可能存在相互矛盾的结果，所以相关研究有待进一步深入。明确何种病原菌成分对巨噬细胞极化具有调控作用，了解巨噬细胞在各类病原菌感染性疾病中的极化表型,进而通过调控巨噬细胞的极化来增强机体抗感染免疫将是今后治疗此类疾病的重要策略之一。