隐丹参酮诱导乳腺癌 MDA—MB—231 细胞凋亡的研究

周南阳+赵虹

[摘要] 目的 探討隐丹参酮对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及其机制。 方法 用不同浓度的隐丹参酮处理MDA-MB-231细胞24 h。采用 MTT、流式细胞术检测不同浓度隐丹参酮对MDA-MB-231细胞活性、凋亡的影响。采用Western blot检测MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平。 结果 与0 μmol/L对照组相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L隐丹参酮组MDA-MB-231细胞存活率显著降低，且呈剂量依赖（P<0.05）。流式细胞仪检测显示隐丹参酮在20 μmol/L浓度时MDA-MB-231细胞凋亡率为（6.34±0.52）%，与对照组（6.09±0.76）%相比无统计学差异（P>0.05）。在40 μmol/L、80 μmol/L浓度时MDA-MB-231细胞凋亡率分别是（18.74±0.65）%、（28.04±3.08）%，与对照组相比有统计学差异（P<0.05），且两浓度组之间相比差异亦有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示，与对照组相比，隐丹参酮在40 μmol/L、80 μmol/L浓度时，MDA-MB-231细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调（P<0.05），同时，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达显著增加（P<0.05）。 结论 隐丹参酮可诱导三阴乳腺癌MDA-MB-231 细胞凋亡，其机制可能与激活Bax、Caspase-3和抑制Bcl-2等凋亡调控基因有关。

[关键词] 隐丹参酮；乳腺癌；MDA-MB-231细胞；凋亡

[中图分类号] R273 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）34-0038-05

Study of cryptotanshinone inducing apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells

ZHOU Nanyang1 ZHAO Hong2

1.Department of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou Obstetrics and Gynecology Hospital， Hangzhou 310008， China； 2.Department of Breast Surgery， the First Affiliated Hospital of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310006， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of cryptotanshinone on the apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism. Methods MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of cryptotanshinone for 24h. The effects of different concentrations of cryptotanshinone on the activity and apoptosis of MDA-MB-231 cells were detected by MTT and flow cytometry. Western blot was used to detect the protein expressions of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in MDA-MB-231 cells. Results Compared with that of the 0 μmol/L control group， the survival rates of MDA-MB-231 cells in 10， 20， 40， 80 μmol/L cryptotanshinone groups were significantly decreased（P<0.05）. And the survival rate was dose-dependent.Flow cytometry showed that the apoptosis rate of MDA-MB-231 cells was（6.34±0.52）% at cryptotanshinone concentration of 20 μmol/L， which was not significantly different from that of the control group （6.09±0.76）% （P>0.05）. The apoptosis rates of MDA-MB-231 cells were （18.74±0.65）% and （28.04±3.08）% respectively at 40 μmol/L and 80 μmol/L， which were different from those of the control group（P<0.05）， and the difference between the two concentration groups was statistically significant（P<0.05）. Western blot results showed that anti-apoptotic protein Bcl-2 expression in MDA-MB-231 cells was significantly down-regulated at cryptotanshinone concentrations of 40 μmol/L and 80 μmol/L， compared with that of the control group（P<0.05）. Meanwhile， the expression of pro-apoptotic proteins Bax and Caspase-3 increased significantly（P<0.05）. Conclusion Cryptotanshinone can induce the apoptosis of triple negative MDA-MB-231 cells， which may be related to the activation of apoptosis regulatory genes including Bax，Caspase-3 and Bcl-2.endprint

[Key words] Cryptotanshinone； Breast cancer； MDA-MB-231 cells； Apoptosis

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年增加，目前居女性癌死亡率第一位[1]。其中，以雌激素、孕激素及人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）表达阴性的三阴乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）恶性程度最高，因其对内分泌治疗和抗Her-2靶向治疗不敏感，故生存率比非三阴性乳腺癌差[2，3]。针对抗三阴乳腺癌的新药研究成为目前乳腺癌治疗的重点之一。隐丹参酮（Cryptotanshinone）是从中药丹参根中提取分离的二萜醌类有效单体，具有抗炎、抗菌、抗动脉粥样硬化等多种生物学活性和药理效应[4，5]。近年来文献报道，隐丹参酮可有效抑制多种肿瘤细胞增殖、侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制血管生成，从而发挥其抗肿瘤的作用[6，7]。目前，有关隐丹参酮对乳腺癌细胞凋亡的影响及其机制尚不清楚。本研究以三阴乳腺癌 MDA-MB-231细胞为研究对象，用不同浓度隐丹参酮干预，检测其对细胞活性和凋亡的影响，检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达水平，从而观察隐丹参酮对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，并初步探究其机制。

1 材料與方法

1.1 材料来源

乳腺癌MDA-MB-231细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，本实验室传代保存。胎牛血清和 RPMI 1640 培养基购自Hyclone 公司。隐丹参酮购自成都曼思特生物科技有限公司（纯度大于98%）（图1），将隐丹参酮溶于 DMSO配制成等20 mmol/L的储备液，分装后于-20℃储存；使用时用无血清 RPMI 1640 培养液稀释为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的工作液，DMSO 终浓度为 0.1%，对照组为含0.1% DMSO的细胞培养液。兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3和 β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG购自 Cell Signaling Technology公司。Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自美国Bio-Rad公司。流式抗体 Annexin V-FICT/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 乳腺癌 MDA-MB-231 细胞在37℃，5% CO2条件下，常规培养于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基。当细胞密度达 90%并处于对数生长期时，用 0.25%胰酶消化传代培养。

1.2.2 细胞活性检测 取对数生长期的MDA-MB-231细胞，接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬液，细胞数1×104/孔，每组设5个复孔。培养 24 h后，吸弃原培养液，各孔分别加入 200 μL 含有不同浓度隐丹参酮的工作液（0、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L），同时设调零孔。继续培养24 h后，利用 MTT 法在波长490 nm 处检测各组样品吸光度值（A490）。细胞存活率=（实验组A值-对照组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%，对照组定义为100%。实验重复3次。

1.2.3 细胞凋亡检测 取对数生长期的MDA-MB-231细胞，接种于6孔板，3×105/孔，每组设3个复孔。培养24 h后，吸弃原培养液，以不同浓度隐丹参酮（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）处理细胞。继续培养24 h后，收集1×105细胞，加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，加入 5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide 混匀后，温室避光孵育染色10 min。用流式细胞仪进行检测。实验重复 3 次。

1.2.4 Western blot 检测蛋白表达 取对数生长期MDA-MB-231细胞，接种于6孔板，1×106/孔，待细胞融合至 80% 时，以不同浓度隐丹参酮（0、40 μmol/L、80 μmol/L）处理细胞。继续培养24 h，收集细胞，4℃预冷的PBS洗涤3次，加入75 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，bradford法测蛋白质浓度。取 25 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE 电泳分离蛋白后转移至 PVDF 膜，用5% BSA/TBST封闭液室温下封闭1 h，洗膜后加入抗Bcl-2、Bax、Caspase-3和 β-actin 一抗（1∶1 000稀释 ），4°C孵育过夜，TBST洗膜 3 次，加入二抗（1∶1 000稀释）室温下孵育2 h，TBST 洗膜 3 次，将化学发光增强液A和B等体积混匀涂抹于PVDF膜上，用Bio-Rad凝胶成像系统获取图像。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 17.0 统计学软件分析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Bonferroni 校正的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隐丹参酮对MDA-MB-231细胞活性的影响

本研究用MTT法检测隐丹参酮对MDA-MB-231细胞活性的影响，结果显示，在隐丹参酮作用24 h后，与对照组（0 μmol/L）相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L组MDA-MB-231细胞存活率分别为（77.07±0.83）%、（62.49±1.00）%、（49.41±0.48）%、（38.98±5.06）%。与对照组相比，各浓度组差异具有统计学意义（P<0.05），两两比较结果显示，各浓度之间差异有统计学意义（P<0.05），表明隐丹参酮可显著抑制MDA-MB-231细胞活性，且呈剂量依赖（图2）。endprint

2.2 隐丹参酮对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

本研究用Annexin V-FICT/PI双染流式细胞术检测隐丹参酮对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，结果显示，隐丹参酮在20 μmol/L浓度时对MDA-MB-231细胞凋亡率为（6.34±0.52）%，与对照组（6.09±0.76）%相比无统计学差异；隐丹参酮在40 μmol/L、80 μmol/L浓度时對MDA-MB-231细胞凋亡率分别是（18.74± 0.65）%，（28.04±3.08）%。与对照组（6.09±0.76）%相比差异具有统计学意义（P<0.05），两浓度组之间差异有统计学意义（P<0.05），表明隐丹参酮浓度大于40 μmol/L时可诱导MDA-MB-231细胞迁移，且呈剂量依赖（图3）。

2.3 隐丹参酮对抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达的影响

本研究用Western blot检测隐丹参酮对MDA-MB-231细胞抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达的影响。结果显示，在隐丹参酮作用24 h后，与对照组（0 μmol/L）相比，40 μmol/L、80 μmol/L组MDA-MB-231细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调，同时，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达显著增加（P<0.05），且两浓度之间差异有统计学意义（P<0.05）（图 4）。

3 讨论

三阴性乳腺癌在临床治疗中常伴随易耐药、易复发、转移率高等特点，是目前乳腺癌治疗中的难题之一[8]。隐丹参酮是从中药丹参根中提取分离的二萜醌类有效单体，具有抗炎、抗菌、抗动脉粥样硬化等多种药理效应[4，5]。随着研究的深入，其抗肿瘤的特性也得到证实[6，7]。近年研究发现，隐丹参酮可通过下调STAT3通路抑制肾细胞癌增殖，诱导细胞凋亡[9]。Kim EJ等[10]通过体内外实验研究发现，隐丹参酮作为一种新的拓扑异构酶Ⅱα抑制剂，对前列腺癌PC-3细胞的生长具有显著的抑制作用，且对正常组织没有明显的细胞毒性。另有动物实验结果表明，在人肺癌裸鼠原位移植模型中，隐丹参酮能有效抑制肿瘤形成，诱导其凋亡，同时可改善机体状况[11]。因此，隐丹参酮抗肿瘤活性具有一定的研究前景。本研究前期研究结果显示，隐丹参酮在体外可显著抑制三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞中c-Src和FAK 蛋白的磷酸化，下调MMP2蛋白，从而抑制其迁移和侵袭。本研究结果表明，隐丹参酮可诱导乳腺癌 MDA-MB-231细胞凋亡，且呈剂量依赖性。Western blot结果表明隐丹参酮显著抑制 MDA-MB-231细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达，增加促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达，初步揭示了隐丹参酮诱导乳腺癌 MDA-MB-231细胞凋亡的分子机制。

细胞凋亡是细胞受环境刺激后，在基因编程调控下产生的细胞自主性死亡过程[12]。肿瘤细胞可通过激活或抑制凋亡相关信号通路，从而维持其不断增殖并避免发生凋亡[12]。其中，Caspase 蛋白酶级联反应、Bcl-2 家族抗凋亡和促凋亡蛋白表达的改变与凋亡的发生密切相关[13]。Caspase-3，被称为“死亡执行蛋白酶”是Caspase 家族中最重要的凋亡执行者之一，是多种凋亡途径的共同下游效应部分[13]。活化的 Caspase-3可直接剪切DNA 依赖性蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶，从而影响细胞DNA的复制、转录及修复过程，最终导致细胞的凋亡[14]。临床研究发现，维生素C和甲氨蝶呤联合治疗可激活Caspase-3抑制三阴性乳腺癌细胞的生长[15]。本研究发现浓度大于40 μmol/L隐丹参酮可显著增加MDA-MB-231细胞Caspase-3表达水平，且随浓度增加作用增强，提示隐丹参酮可能通过激活Caspase-3诱导MDA-MB-231 细胞凋亡。

Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡信号通路中关键的凋亡调节因子[16]。其中，Bcl-2是抑制凋亡作用发挥的主要蛋白，为线粒体膜的整合蛋白，其基因定位于18号染色体21区[17]。Bcl-2可通过抑制线粒体内细胞色素C和凋亡诱导因子AIF等促凋亡蛋白的释放阻止凋亡的进程[17]。Bax是促凋亡的代表成员之一，其位于19q13.3～q13.4区[18]。Bax在接收到凋亡信号刺激被激活，移位并插入线粒体外膜后形成Bax大孔道，破坏线粒体膜的完整性发挥促凋亡作用[18]。此外，Bcl-2和Bax可通过同源和异源性二聚体来调节细胞凋亡[19]。在正常情况下，Bcl-2和Bax在细胞中表达量相对稳定，而当Bcl-2在细胞内高表达时，Bax/Bax同源二聚体的大量解离，促使细胞出现抗凋亡作用，从而引起肿瘤的发生[19]。研究发现，人参皂苷可通过上调Bax/Bcl-2比值协同紫杉醇诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡[20]。本研究发现浓度大于40 μmol/L 隐丹参酮可抑制 MDA-MB-231 细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达，增加促凋亡蛋白Bax，上调Bax/Bcl-2比值，提示隐丹参酮促凋亡机制可能是通过下调Bcl-2、上调Bax，破坏线粒体膜完整性而促发。

综上所述，隐丹参酮可诱导三阴乳腺癌MDA-MB-231 细胞凋亡，其机制可能与激活Bax、Caspase-3和抑制Bcl-2等凋亡调控基因有关。本研究为隐丹参酮应用于乳腺癌的治疗积累了前期实验基础。但是，有关隐丹参酮对乳腺癌细胞其他凋亡调节蛋白表达的影响，其与化疗药物及靶向药物等治疗手段的配伍协同效应，以及在动物模型上抗癌效应及机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2017-09-29）endprint