柠檬酸发酵废渣及食用菌渣复配基质二次转化生产氨基葡萄糖工艺

丁振中，冯小海，张超，雷鹏，史劲松，李恒

（1.扬州日兴生物科技股份有限公司，江苏扬州 225601；2.江南大学，江苏无锡 214122）

氨基葡萄糖简称氨糖，化学名称为2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，其作为营养品和药品具有广泛的应用，是骨关节炎的膳食补充剂和临床治疗的辅助用药，能够强化软骨结构，预防关节病变，修复骨质疏松导致的软骨受损，舒缓关节炎引起的疼痛、僵硬和肿胀[1]。随着世界范围内人口结构的老龄化，骨关节炎患者越来越多，氨糖作为膳食补充剂被大量用于骨关节炎的预防和辅助治疗，全球氨糖市场已发展到3万吨的规模，制品产业链总产值在40亿美元左右，具有广阔的市场前景[2]。

然而，随着氨糖市场的快速发展，其产品品质和原料来源问题逐渐突出。目前，市场上的氨糖主要为甲壳源氨糖，是以虾蟹壳为原料，通过脱脂、去钙等步骤进行生产，虽然产品纯度能够满足医药和食品标准，但仍存在微量过敏因子，易引发皮疹、骚痒、过敏性哮喘等症状[3-4]。近年来，国际市场上产生了安全性更好的植物源氨糖，其原料不是来自动物甲壳素，而是来自植物原料转化而成的真菌几丁质[5]。

本研究采用工业发酵柠檬酸的废弃玉米渣（含菌丝体）和食用菌工厂化栽培产生的大量菌根、菌渣为原料生产植物源氨糖。研究创新的使用生物转化富集技术，通过对基料进行组分调整，再接种绿色木霉进行生物质转化，提高原料几丁质含量；同时，首次使用物理场辅助催化技术，采用超声波-酸解联用技术，减少酸碱用量，提高水解度。

1 材料与方法

1.1 菌种

绿色木霉（Trichoderma viride），由扬州日兴生物科技股份有限公司研发部自主分离并保藏于公司研发中心，本研究所用菌剂为扬州日兴生物科技股份有限公司自主制备的绿色木霉粉剂，有效活菌数≥109/g。

1.2 废弃物基质来源

工业发酵柠檬酸的废弃玉米渣（含菌丝体），食用菌生产菌渣。

1.3 培养基及试剂

玉米渣，食用菌渣，玉米粉，(NH4)2SO4，KH2PO4，吐温80。

1.4 发酵工艺

将玉米渣、食用菌渣按一定比例混合为复配基质，然后再向复配基质中加入玉米粉12%、(NH4)2SO42.5%、KH2PO41.5%、吐温80 0.5%，加入适量的水，搅拌均匀后进行灭菌处理，冷却后拌入2.5%的绿色木霉粉剂。拌料均匀后浅盘发酵，发酵温度为30℃，发酵时间为48 h。

1.5 发酵基质中氨基葡萄糖含量检测

氨基葡萄糖的提取按照Guerriero等人的方法[6]。称取1 g发酵前或发酵后基质，在研钵内用液氮研磨成粉末，然后悬浮于2mL去离子水中，13 000 g离心10 min，弃上清，将沉淀在冷冻干燥机中过夜冻干。称取冻干后的粉末5 mg，加入1mL 6mmol HCl，置于100℃水浴中4 h，随后冷却至室温，吸取0.2mL测定氨基葡萄糖含量。

氨基葡萄糖按照Morgan-Elson方法检测[7]。取0.2mL待测液加入乙酰丙酮试剂1.0mL，90℃水浴1 h，冷却至室温，慢慢加入10mL 96%乙醇，然后加入DMAB试剂1.0mL，混合均匀。混合后室温放置1 h，530 nm处比色，根据标准曲线计算胞内氨基葡萄糖的产量。

乙酰丙酮试剂配制：1.5mL乙酰丙酮，溶于50mL 1.25 mol/L碳酸钠溶液中，现用现配。

DMAB试剂配制：1.6 g对二甲氨基苯甲醛（DMAB）溶于30mL浓盐酸和30mL 96%的乙醇中，-4℃保存。

1.6 氨基葡萄糖粗提液制备

将发酵后的菌丝体复合物置于真空冷冻干燥机中，设置真空度为-2 MPa，温度为-10℃，真空冷冻处理24 h。然后向发酵菌丝体复合物中加入0.2 mmol 20%醋酸溶液，搅拌30 min后置于超声仪中，设置超声功率为60 W、温度为40℃、时间为20 min，抽滤即可得到含有氨基葡萄糖的粗提取液。按照1.5中的Morgan-Elson方法测定粗提液中氨基葡萄糖含量，并计算氨基葡萄糖提取率。

2 结果与分析

2.1 玉米渣、食用菌渣复配比例对发酵氨基葡萄糖产量的影响

真菌中氨基葡萄糖主要来自于细胞壁几丁质的水解。如图1所示，玉米渣与食用菌渣复配时，较高的玉米渣含量有利于绿色木霉菌的生长，从而提高菌丝体中几丁质的含量。当玉米渣-食用菌渣配比2∶1时，最有利于菌体生长产生几丁质，因而氨基葡萄糖含量最高。较低的玉米渣配比则不利于菌体生长。柠檬酸发酵玉米渣中，总糖含量高达35%以上[8]，且以易被生物利用的淀粉为主，在发酵过程中，玉米渣作为主要碳源给菌体生长提供必要的能量，因此，玉米渣含量较高时有利于菌体的生长。而食用菌菌渣中主要营养成分为粗蛋白，在发酵过程中为绿色木霉提供氮源，此外食用菌菌渣还富含微量元素，在高配比时，过多的微量元素不利于绿色木霉的生长[9]。

图1 玉米渣-食用菌渣配比对绿色木霉产氨基葡萄糖的影响

2.2 初始含水量对绿色木霉发酵氨基葡萄糖的影响

本研究考察了初始含水量为45%、50%、55%、60%、65%和70%时，绿色木霉发酵产氨基葡萄糖（几丁质水解）的规律，如图2所示。含水量较低时，不利于绿色木霉菌丝体的生长，随着含水量的增加，菌丝体生长加快，几丁质含量增加，氨基葡萄糖产率高，当含水量为60%时，氨基葡萄糖含量达到最高15.1%，继续增加培养基水分含量则会降低菌体生长。水分含量是绿色木霉固态发酵中的重要参数，水分含量过高，会造成固体物料结块，导致孔隙度降低，响固态过程中的氧的传递和热量的交换；而水分不足则会造成营养物质的不充分利用，引起微生物生长缓慢、目标产物合成效率较低[10]。

图2 含水量对绿色木霉固态发酵氨基葡萄糖产量的影响

2.3 玉米渣-食用菌渣复配基质处理前后氨基葡萄糖含量对比

本研究对比了玉米渣-食用菌渣复配基质（复配比为2∶1）在用绿色木霉发酵前后氨基葡萄糖的含量变化。如图3所示，发酵前，复配基质中的氨基葡萄糖含量仅为5.7%，经绿色木霉生物转化后，复配基质中的氨基葡萄糖含量达到15.4%，氨基葡萄糖含量提高了9.7%，这说明使用绿色木霉确实能够转化柠檬酸发酵玉米渣及食用菌渣这些工农业生产废弃物，使其变废为宝，成为具有工业化前景的氨基葡萄糖来源。

图3 发酵前后玉米渣-食用菌渣复配基质中氨基葡萄糖含量变化

2.4 超声-酸解联合制备氨基葡萄糖粗提液工艺优化

本研究考察了超声时间为60 min，超声温度为80℃时，不同超声功率对提取液中氨基葡萄糖得率的影响，结果见表1。随着超声功率的增大，粗提液中氨基葡萄糖得率增加，当超声功率在60～80 W时，粗提液中氨基葡萄糖得率变化不大，从经济生产的角度考虑，以60 W作为最佳提取功率。

表1 超声功率对粗提液中氨基葡萄糖得率的影响

考察在超声功率为60 W，超声温度为80℃时，超声时间对粗提液中氨基葡萄糖得率的影响，结果见表2。随着超声时间的增加，绿色木霉菌丝体中的几丁质逐渐释放到溶液中，并且在酸环境中水解为氨基葡萄糖，超声时间越长，粗提液中氨基葡萄糖得率越高，当超声时间为40～60 min时，粗提液中的氨基葡萄糖得率达到最高值，且变化不再显著。因此，从经济生产的角度考虑，本研究采用40 min作为最佳超声时间。

表2 超声时间对粗提液中氨基葡萄糖得率的影响

考察在超声功率为60 W，超声时间为40 min时，超声温度对粗提液中氨基葡萄糖得率的影响，结果见表3。随着温度的提高，菌丝体上的几丁质释放量及水解程度增加，粗提液中的氨基葡萄糖含量增加。当温度达到60℃以上后，粗提液中氨基葡萄糖得率最高，且不再随温度升高有显著变化。从节能生产的角度考虑，确定最佳的超声提取温度为60℃。

表3 超声温度对粗提液中氨基葡萄糖得率的影响

采用物理场辅助催化技术，可简化几丁质分离和降解过程，使酸碱耗量大幅度降低，并使资源化利用成为可能。本研究利用超声波的空化效应，使菌丝体表面破碎，有利于菌丝体细胞壁充分剥离。由于几丁质主要存在于细胞壁中，后续的酸解仅对分离出的细胞壁进行，而避免同时水解其他有机质，该项技术可以大幅度减少后续的酸碱耗量[11]。

3 结论

本研究创新性的使用生物转化富集技术，通过对工农业废弃基料进行组分调整和预处理，再接种绿色木霉利用浅盘固态发酵法进行二次生物质转化，确立了最佳的玉米渣-菌渣复配比（2∶1）和发酵初始含水量（60%），使原料氨基葡萄糖（几丁质水解）含量提高了9.7%，突破了原料几丁质含量低导致的高成本瓶颈。此外，本研究首次使用物理场辅助催化技术，采用超声波-酸解联用技术，确立了最佳超声强度（60 W）、最佳超声时间（40 min）和最佳超声温度（60℃），减少了酸碱用量，提高水解度，解决了几丁质分离降解过程中酸用量大的问题，使粗提液中氨基葡萄糖得率达到90%以上。本技术可再生利用工业发酵柠檬酸的废弃玉米渣（含菌丝体）和食用菌工厂化栽培产生的大量菌根、菌渣，实现了大宗废弃物的资源化和高值化利用，对农业增效、农民增收和产业环境的改善具有重要意义。

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