梓醇对AD模型细胞中海马神经元细胞凋亡的影响

宋冲，曹斌

（长沙医学院，湖南 长沙 410219）

引言

谷氨酸属于哺乳动物脑内含量最高的一类兴奋性氨基酸，在人体生理活动中负责协调运动、认知等功能，当脑内谷氨酸含量过高时即可造成神经元损伤[1]。当前阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的治疗中即有学者提出通过干预谷氨酸损伤神经元达到治疗AD 患者的目的，本文为深入研究梓醇对海马神经元凋亡的影响，利用大鼠制作AD 模型完成观察。

1 材料及方法

1.1 一般材料 梓醇自上海远慕生物科技有限公司处购得，CAS 号：2415-24-9，DMEM/F12 培养基自GIB 公司处购得，噻唑蓝（MTT）、多聚赖氨酸从sigma公司购买，LDH 检测试剂由南京建成生物工程研究所提供，流式细胞仪器为德国CELLASIC 生产，型号ONIX perfusion syste。SD 大鼠来自凯学生物科技（上海）有限公司提供。

1.2 方法

海马神经的培养与测定：无菌条件完成海马分离，培养基清洁后将海马组织剪成1 mm3小块，利用胶原酶消化40 min，胶原酶pH 值控制在6.5-7.0，浓度0.5%，温度37℃，每10 min 完成摇晃吹打1 次，后续利用200 目钢网完成过滤，离心10 min（转速1000 r/min），滤取上清液后加入一定培养液制成细胞悬液，控制细胞密度保持在1×109/L，随后以1 ml/孔接种在24 孔培养板内，接种2 d 后更换低血清培养液，24 h 后在再换为DEEM/F12 培养液，后续每2 d 更换培养液1 次，更换量为原液量的一半。

分组：取出已培养7-9 d 的海马神经元，利用随机数字法分为对照组、AD模型组、干预组，对照组不进行干预，AD 模型组给予0.1 mmol/l 谷氨酸，干预组再给予谷氨酸之前给予浓度为0.2、1.0、5.0 mg/l 的梓醇，完成干预0.5 h 再给予谷氨酸，培养1 d 后完成检测观察，对照组、AD 模型组各10 个复孔，干预组高、中、低浓度组各设5 个复孔。

神经元存活情况观察：加入20 ul 浓度为5 g/L 的MTT，控制温度在37℃条件下，置入孵育箱（CO2浓度控制在5%），完成4 h 孵育后取出培养液，加入150 ul二甲亚砜，避光条件下完成震荡，使用酶标仪完成570 nm 处吸光度值的测定。

LDH 测定：收集细胞培养上清液，利用LDH 检测试剂盒完成LDH40 nm 处吸光度值检测。细胞凋亡：利用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制备单细胞悬液，控制细胞密度至1×109/L，取1 ml 悬液，完成离心后撇去上层清液，再加1 ml 冷PBS，离心后再撇去上清液，使细胞悬浮于缓冲液内，加入AnnexinVFITC（10 ul）及PI（5ul），等待15 min，加入缓冲液后使用流式细胞仪完成细胞凋亡情况检测。

1.3 观察指标 观察3 组细胞凋亡情况、DTH、MTT。

1.4 统计学分析 使用SPSS 23.0 软件处理数据，（）表示计量资料，t 检验，%表示计数资料，χ2检验，P＜0.05 有统计学意义。

2 结果

从下表1 可知，AD 模型组细胞凋亡率、LDH 显著高于对照组，MTT 显著更低（P＜0.05），干预组内细胞凋亡率从高浓度、中等浓度、低浓度组逐次上升，MTT则从低浓度至高浓度逐次升高，LDH 从高浓度至低浓度逐次降低，高浓度组细胞凋亡率、MTT、LDH 与对照组对比无明显差异（P＞0.05）。

3 讨论

AD 是一种以慢性进行性的记忆力减退、认知功能障碍及精神行为异常为主要临床特征的神经变性疾病，是引起痴呆的最常见原因。AD 的发病率随年龄增长有上升趋势，随着全球步入老龄化社会，AD 发病人数急剧上升。AD 发病后患者随病情进展认知能力、记忆能力、运动能力逐渐下降，最终丧失生活自理能力，为患者及社会造成严重负担[2]。

在临床治疗的尝试中，有学者利用梓醇治疗本病且取得良好效果，猜测梓醇可在AD 患者治疗中对其神经细胞起到一定保护作用，但具体机制尚未证实[3]。后续许多学者围绕β-淀粉样蛋白进行研究，发现梓醇可减轻β-淀粉蛋白诱导的细胞凋亡，初步证实梓醇在本病中的治疗价值，但有关谷氨酸过量所引起神经损伤方面研究较少，本文为弥补研究空白，更全面探悉梓醇对海马神经元凋亡的影响，利用将3 组比较的方式完成本次研究[4]。

表1 三组LDH、MTT、细胞凋亡率对比（）

表1 三组LDH、MTT、细胞凋亡率对比（）

注：与对照组比较，＊P＜0.05；与对照比较，#P＞0.05。

本次观察中，AD 模型组在给予谷氨酸后其细胞凋亡率较对照组明显上升，MTT 显著下降，而LDH 显著升高（P＜0.05），进一步验证了谷氨酸过量对神经细胞的损伤作用。而在干预组的观察中发现，在加入氨基酸前，通过加入不同浓密度梓醇的梓醇可达到保护海马神经元的目的，且以浓度越大效果越佳，当浓度至5.0 mg/l 时，细胞凋亡率、MTT、LDH 与对照组比较已无显著差异（P＞0.05）。在张晓双[5]等人的研究中进一步指出梓醇对于血管性痴呆大鼠神经元具有一定保护作用，可提高大鼠的学习能力及记忆能力，本次研究与其研究存在一定相似性。

综上所述，梓醇在AD 模型中可有效控制由谷氨酸过量引起的海马神经元凋亡。