儿茶素对脂肪前体细胞增殖和分化的影响

寇艳波，刘庆亚，张 波，汤仁仙，王玉刚 (徐州医科大学江苏省免疫与代谢重点实验室,江苏徐州221004)

0 引言

肥胖已成为全球流行性疾病。肥胖及其伴随的各种并发症,如高血脂、脂肪肝、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病,甚至肿瘤等正严重威胁着人类生命健康［1－2］。肥胖发生的根本原因是能量摄入长期大于能量消耗,过多的能源物质储存于白色脂肪细胞中,造成成熟白色脂肪细胞的增生和肥大,最终引发肥胖［3］。机体中除了含有白色脂肪细胞外还含有另外两种脂肪细胞：棕色脂肪细胞和米黄色脂肪细胞［4］。米黄色脂肪细胞主要存在于白色脂肪组织中,可与白色脂肪细胞来源于相同的前体细胞［5－6］。棕色脂肪细胞主要存在于棕色脂肪组织中。米黄色和棕色脂肪细胞均可高表达解偶联蛋白1(ucoupling protein 1,Ucp1),将化学能转变成热能,是机体代谢的重要调控者。增加米黄色或棕色脂肪细胞的量,将增加机体能量的消耗,对于肥胖的发生具有重要的抑制作用。由于人体中棕色脂肪细胞只存在于婴幼儿时期,因此,促进米黄色脂肪细胞的含量将是防治肥胖的新手段［7］。

白色和米黄色脂肪细胞的形成均受转录因子Pparγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)的调控。脂肪前体细胞经不同的环境因素刺激可在Pparγ其他关键调控因子的影响下表达不同的功能蛋白［8］。白色脂肪细胞高表达p-HSL(phosphorylated Hormone sensitive lipase)和Perilipin 1；米黄色脂肪细胞在关键转录因子Prdm16(PR domain containing 16)的参与调控下高表达Ucp1。儿茶素在我们日常食用的食物和水果中分布广泛,其中绿茶中含量非常高。绿茶素有提神清心、去脂减肥的功效,但其去脂减肥的作用机制尚不完全清楚。联合利华曾通过临床实验证明儿茶素对减肥的作用,以普通饮料为对照,在不改变参与者正常生活习惯的情况下,连续饮用高儿茶素含量绿茶90天后,参与者们体质量、腰围和内脏脂肪均明显减少,表明儿茶素极有可能是绿茶具有减肥作用的关键物质。研究［9］表明儿茶素能够影响成熟脂肪细胞的形成,因此具有潜在的减肥作用。

为更全面地了解儿茶素影响脂肪细胞形成的机制,本实验着重从儿茶素对脂肪前体细胞的增殖,对脂肪前体细胞向白色脂肪细胞的分化和对脂肪前体细胞向米黄色脂肪细胞分化的影响进行了研究,现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠脂肪前体细胞系3T3-L1购自武汉大学细胞保藏中心。细胞诱导分化试剂包括IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、地塞米松、吲哚美辛、罗格列酮、三碘代-L-甲状腺原氨酸购自Sigma。小鼠胰岛素购自Peprotech。油红染料购自Sigma。白色脂肪细胞标志性蛋白Pparγ、p-Hsl、Perilipin 1和米黄色脂肪细胞标志性蛋白Ucp1(Uncoupling protein 1)、Prdm16抗体购自 Abcam,内参 β-Actin抗体购自Abclonal。儿茶素购自生工生物工程有限公司。CCK-8试剂盒购自Dojindo。

1.2 方法

1.2.1 脂肪前体细胞系诱导分化 用加有10%胎牛血清以及100 U/mL的青霉素和0.1 mg/mL的链霉素的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)高糖培养基,培养小鼠脂肪前体细胞3T3-L1至细胞汇合。更换新鲜培养基后继续培养48 h使细胞接触抑制。48 h后用无菌的PBS将细胞充分洗涤,换用新的含有白色脂肪细胞分化混合液(2 μg/mL地塞米松,0.5 mM IBMX,5 μg/mL胰岛素)或米黄色脂肪细胞分化混合液(2 μg/mL地塞米松,0.5 mM IBMX,1 μM罗格列酮,1 nM三碘代-L-甲状腺原氨酸,125 μM吲哚美辛,5 μg/mL胰岛素)的培养基再次培养48 h,诱导分化。最后换用含有10 μg/mL胰岛素(维持白色脂肪细胞分化)或5 μg/mL胰岛素,1 μM罗格列酮,1 nM三碘代-L-甲状腺原氨酸(维持米黄色脂肪细胞分化)的新鲜培养基继续培养细胞并隔日换液,于第8天左右完成脂肪前体细胞的分化。

1.2.2 油红染色 用异丙醇配制0.5%的油红母液(现用现配),溶液经滤纸过滤后,按照油红母液 ∶水(6∶4)的比例进行稀释,获得油红染色工作液。分化成熟的脂肪细胞经PBS洗涤2遍后,加入4%多聚甲醛固定10 min。固定后的细胞经PBS漂洗后加入60%异丙醇浸洗2 min。弃掉异丙醇后,加入油红工作液染色15 min。弃掉油红染液后,细胞用60%的异丙醇再次洗涤至背景基本无色。显微镜观察脂滴形成情况。

1.2.3 荧光定量PCR 收集分化前和分化后的3T3-L1细胞,提取RNA,取总RNA 1 μg进行逆转录获得总cDNA,以不同组的cDNA为模板利用Roche Light Cycler 480荧光定量PCR仪检测米黄色脂肪细胞标志性基因的转录情况,内参为 β-actin,引物序列如下：β-actin：5′CGTTGACATCCGTAAAGACC 3′和 5′AACAGTCCGCCTAGAAGCA 3′；Ucp1：5′AGAGGTCGTGAAGGTCAGAATG 3′和 5′TGACATTTCTCATTAGATTAGGGGT 3′；Pparγ：5′TTCAAGGGTGCCAGTTTCG 3′和 5′CCATCTTTATTCATCAGGGAGG 3′；Prdm16：5′GAGATGCTGACGGATACAGAGGT 3′和5′GGCGAGGTTTTGGTCATCAC 3′。

1.2.4 Western blot 细胞经含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解后,测定蛋白浓度。每孔上样总蛋白30 μg进行SDS-PAGE,转印至PVDF膜后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h,用相应一抗4℃孵育过夜,洗涤后二抗孵育1 h再次洗涤后分别检测目的蛋白存在。

1.2.5 细胞增殖实验 小鼠脂肪前体细胞3T3-L1经血球板计数后,调整细胞浓度至2×103个/mL,分为四组(分别加入终浓度 0、25、50、100 μM 的儿茶素),接种到含有新鲜DMEM(高糖)完全培养基的96孔板中,每组12孔(3个孔为一个平行组),分别于0 h、24 h、36 h和48 h通过CCK-8试剂盒测定细胞的相对数量(按照操作手册进行)。

1.3 统计学处理 采用Graph Pad Prism 5软件进行统计分析,实验数据采用x±s表示,两组间比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 儿茶素抑制脂肪前体细胞3T3-L1增殖 为检测儿茶素是否能够影响脂肪前体细胞的增殖,本研究通过CCK-8实验检测了儿茶素对脂肪前体细胞生长的影响。3T3-L1经胰酶消化后接种到含有不同浓度儿茶素的新鲜培养基中,每隔24 h观察细胞形态并检测细胞相对数量。如图1A所示儿茶素能明显抑制脂肪前体细胞的增殖,含有25 μM儿茶素的组别,3T3-L1最终生长量只达到对照组的55%左右；更高浓度的儿茶素几乎完全抑制了细胞增殖。显微镜下观察结果显示,儿茶素并没有影响细胞的正常形态(图1B),虽然50 μM 和100 μM 的儿茶素几乎完全抑制3T3-L1的增殖,但是并没有出现细胞形态的异常或细胞悬浮的现象,暗示儿茶素可能并不会促进3T3-L1凋亡或坏死。

2.2 儿茶素抑制脂肪前体细胞3T3-L1向白色脂肪细胞分化 为确定儿茶素是否能够抑制白色脂肪细胞的形成,我们研究了儿茶素对脂肪前体细胞向白色脂肪细胞分化的影响。由于高浓度的儿茶素具有强烈的细胞生长抑制作用,因此选用25 μM的儿茶素干预脂肪前体细胞向白色脂肪细胞的分化。3T3-L1完成接触抑制后,添加白色脂肪分化混合液的同时,加入25 μM的儿茶素,并使后期维持分化的过程中,培养基中始终含有25 μM的儿茶素。细胞分化完成后,首先通过油红染色观察脂滴的形成情况,儿茶素的干预明显抑制了白色脂肪细胞中脂滴的累积(图2A)。与之相对应的是,Western blot结果表明,白色脂肪细胞标志蛋白Perlipin 1及磷酸化的Hsl的表达均受到明显抑制,并且调控白色脂肪细胞形成的关键转录因子 Pparγ的表达也受到明显抑制(图2B),这与Lee等［10］的结果相一致。由此可知,儿茶素能够抑制脂肪前体细胞向白色脂肪细胞分化。

图2 儿茶素对白色脂肪细胞形成的影响

2.3 儿茶素不影响米黄色脂肪细胞的形成 为明确儿茶素是否能够调控米黄色脂肪细胞的形成,我们检测了儿茶素对脂肪前体细胞向米黄色脂肪细胞分化的影响。与白色脂肪细胞分化实验相同,从刺激分化开始,始终保持培养基中含有25 μM儿茶素。油红染色结果显示儿茶素同样可以抑制米黄色脂肪细胞中脂滴的累积(图3A),虽然与白色脂肪细胞形成过程中结果类似,儿茶素轻微地抑制了Pparγ的表达,但不同的是儿茶素并不影响调控米黄色脂肪细胞形成的关键转录因子Prdm16以及米黄色脂肪细胞功能蛋白Ucp1的表达(图3B、C)。综合以上结果可知,虽然儿茶素能够抑制米黄色脂肪细胞中脂滴的形成,但其并不影响米黄色脂肪细胞将化学能转变为热能的生物学功能。

A：油红染色检测胞内脂滴的形成；B：Western blot检测米黄色脂肪细胞标志蛋白的表达；C：荧光定量PCR检测米黄色脂肪细胞标志基因的转录

3 讨论

随着人们物质生活水平的不断提高和生活方式的改变,肥胖人群比例日趋增加且愈发低龄化。其伴随的各种并发症正严重威胁着人类的身心健康［11］。肥胖发生的根本原因主要是能量摄入长期高于能量消耗,过多能源物质储存造成白色脂肪细胞的增生和肥大,导致机体肥胖体征。因此,减少成熟白色脂肪细胞的数量或减小它们的体积,对于肥胖的防治均是有效的方法。此外,增加机体能量消耗减少能源物质的堆积也将是防止肥胖的有效手段。米黄色脂肪细胞高表达Ucp1,能将化学能转变为热能,可消耗体内储存的能源物质,它们的增多能够对肥胖的发生起到重要的抑制作用。由此可知,不管是减少脂肪细胞的数目还是抑制脂肪前体细胞向白色脂肪细胞分化或者促进脂肪前体细胞向米黄色脂肪细胞分化均是防治肥胖的有效方法。

儿茶素作为日常食物中广泛存在的小分子物质,已被多次证明具有减肥的功效。已有研究［12］表明,儿茶素能够抑制白色脂肪细胞的形成,因此能够起到减肥的作用,本研究结果与之相符。添加25 μM的儿茶素后,脂肪前体细胞3T3-L1向白色脂肪细胞的分化受到明显抑制,油红染色显示胞内脂滴积累量明显减少。同时经CCK-8实验检测,儿茶素明显抑制了脂肪前体细胞3T3-L1的增殖。由于脂肪细胞接触抑制后,在刺激剂作用下重新进入有丝分裂,经克隆增殖后才进行分化［13］。儿茶素对脂肪前体细胞增殖的抑制作用可能是其抑制3T3-L1向白色脂肪细胞分化的关键原因。然而,在后续我们检测儿茶素对脂肪前体细胞向米黄色脂肪细胞分化的过程中,发现同样浓度的儿茶素,虽然抑制了米黄色脂肪细胞中脂滴的形成,但并不影响米黄色脂肪细胞分化关键转录因子Prdm16和关键功能蛋白Ucp1的表达,说明儿茶素可能并不影响脂肪前体细胞向米黄色脂肪细胞的分化。这也暗示了,儿茶素对脂肪前体细胞增殖的抑制作用并不是其抑制脂肪前体细胞向白色脂肪细胞分化的主要原因。此外,本研究观察到在脂肪前体细胞向白色脂肪细胞分化过程中儿茶素明显抑制了Pparγ的表达,而在向米黄色脂肪细胞分化过程中只有轻微的抑制作用,这可能与两种分化过程受到的其它刺激因素不同有关。如米黄色脂肪形成过程中需要罗格列酮的存在,而恰有研究证明罗格列酮可以上调舌癌Tca8113细胞中Pparγ的表达。

儿茶素抑制脂肪前体细胞向白色脂肪细胞分化的研究较多。近年来,有研究［14］发现儿茶素能够结合67LR(67 kDa laminin receptor),进而影响3T3-L1中脂多糖引起的TLR4(toll-like receptor 4)的活化,67LR可能是儿茶素抑制脂肪前体细胞向白色脂肪细胞分化的直接受体。也有研究［15］表明儿茶素可以通过结合脂筏,扰乱脂筏的正常功能而抑制脂肪前体细胞向米黄色脂肪细胞的分化。儿茶素的干预也影响了参与脂肪细胞分化的多条信号通路的改变,如PI3K-AKT、MEK/ERK、AMPK 等,这些信号途径的改变进一步影响下游调控脂肪细胞分化的细胞因子的表达,最终决定脂肪前体细胞的分化命运［16］。儿茶素抑制米黄色脂肪细胞形成过程中脂滴的形成,但不影响米黄色脂肪细胞中Prdm16和Ucp1的表达,可能跟这两个过程分别受不同信号通路调控有关。

本研究结果证明儿茶素能够抑制脂肪前体细胞增殖,因此能够一定程度上减少脂肪前体细胞的数量,进而减少引起肥胖的成熟白色脂肪细胞的数量；儿茶素还能够抑制脂肪细胞中脂滴的形成,抑制脂肪前体细胞向白色脂肪细胞的分化,可进一步减少成熟白色脂肪细胞的数量；此外,儿茶素并不影响脂肪前体细胞向米黄色脂肪细胞的分化,不影响米黄色脂肪细胞对储存的能源物质的消耗。总体来讲,儿茶素可以在不抑制米黄色脂肪细胞能量消耗的情况下减少成熟白色脂肪细胞的数量,极有可能是儿茶素去脂减肥的关键原因。