猪流行性腹泻病毒流行株M基因的克隆与序列分析

丁卫星，王荣谈，李春华，，夏 叶，郭佳宏，倪建平，缪德年，*，赵 敏*

（1上海瑞丰农业科技有限公司，上海201106；2上海市农业科学院上海种猪工程技术研究中心，上海201106；3上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106；4上海佳牧生物制品有限公司，上海201106）

猪流行性腹泻是一种由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的，以严重的肠炎、腹泻、呕吐、脱水和仔猪高死亡率为显著特征的猪急性高度接触性肠道传染病［1］。自2010年底中国猪流行性腹泻疫情暴发以来，该病持续在中国流行蔓延，给养猪生产带来了巨大的经济损失，直至2015年中国部分地区的猪场仍然发病严重［2-4］。PEDV基因组全长为28 033 nt，编码4种主要结构蛋白［纤突蛋白（Spike protein，S）、小包膜蛋白（Envelope，E）、膜糖蛋白（Membrane，M）、核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）］和4种非结构蛋白（1a、1b、3a、3b）。其中M蛋白（27—32 kD）在病毒囊膜蛋白中含量最多，并通过与S蛋白和N蛋白互作参与病毒的组装。M蛋白具有跨膜结构，短的N末端结构域位于病毒外，C端结构域在病毒内［1］。在补体存在的条件下，M蛋白可诱导机体产生中和抗体，而且M蛋白还可以诱导α干扰素的产生［5］。本研究克隆了发病猪群临床分离株PEDV D1和D3的M基因序列，并分析目前我国PEDV流行毒株M蛋白的抗原性，以期为PEDV疫情诊断方法的建立和防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

PEDV临床毒株D1和D3分离自具有腹泻临床症状的仔猪。大肠杆菌JM109感受态细胞、pMD18-T载体、RNA提取试剂盒、高保真Prime STAR HSDNA聚合酶、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、DL 2000 DNA Marker、质粒小量提取试剂盒均为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 引物

从GenBank中下载近年来流行的PEDV M基因核苷酸序列，经比对后根据其保守序列设计1对引物，用于 M基因的扩增。M1：5’-AGTCTTACATGCGAATTGACC-3’，M2：5’-AGCTGACAGAAGCCATAAAGT-3’，扩增片段大小为777 bp，引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。

1.3 样品处理

按照RNA提取试剂盒说明书提取PEDV临床毒株D1和D3的总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PEDV M基因的PCR扩增（98℃2 min；98℃10 s，55℃10 s，72℃1 min，30个循环；72℃延伸10 min）。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 PEDV M基因的克隆与序列测定

将PEDV M基因的PCR产物纯化回收后，克隆于pMD18-T载体中，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，在LB培养基中过夜培养，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，以PCR方法鉴定重组质粒，阳性质粒交宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.5 PEDV M基因遗传进化分析

采用DNAStar软件对测得的PEDV D1和D3的M基因序列与我国其他地区的分离株以及国外分离株（表1）的PEDV M基因进行同源性分析，采用MegAlign软件构建系统进化树。

表1 用于进行M基因序列比较的PEDV毒株Table 1 PEDV strains for sequence com parison of M gene

1.6 PEDV M蛋白二级结构与抗原性分析

利用DNAStar软件Protein不同方法对其进行二级结构预测。运用在线软件预测可能存在的抗原位点（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）。

2 结果与分析

2.1 M基因的扩增

利用RT-PCR方法扩增PEDV临床毒株D1和D3的M基因全长，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，与预期大小相一致，约为777 bp（图1）。

图1 猪流行性腹泻病毒M基因的RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCR amplification of M gene of PEDV

2.2 PEDV M基因序列分析

每个分离毒株取2个阳性质粒送公司测序。测序结果表明：相同毒株的M基因序列完全一致，PEDV分离株D1和D3的M基因大小分别为693 bp和681 bp，分别编码231个和227个氨基酸。以GeneBank上登录的CV777（AF353 511.1）作为参考，分析M基因碱基的变化，发现D1株存在12个核苷酸的插入［TTATGCTAGTAC（35—46）］，3个核苷酸的突变（C198T、T388C、C448T），导致氨基酸存在 4氨基酸（MLVL）的插入（13—16）和2个位点的氨基酸发生改变（C134R、L154F）。D3株存在12个核苷酸的突变（G37C、T125C、G180A、C198T、C213T、C222T、C234T、T285C、T348A、A603C、T618C、G640T），导致 3个位点的氨基酸发生改变（E13Q、V42A、A214S）（图 2）。

图2 分离株D1和D3的M基因序列Fig.2 M gene sequence of PEDV isolates D1 and D3

2.3 M基因序列同源性及进化树分析

运用DNAStar软件将流行毒株的M基因序列与GenBank上已发表的M基因参考序列进行比较分析，结果显示：流行毒株M基因之间的核酸序列同源性为98.1%，M蛋白之间的氨基酸序列同源性为97.8%；与参考毒株核苷酸和氨基酸的相似性分别为97.2%—100%和96.9%—100%。系统发育树结果表明：流行毒株 D1与参考株 EAS1、SM98、CHM2013分离株亲缘性较近，流行毒株 D3与参考株PEDV-LY、PEDV-WS、CH22分离株亲缘性较近，处于同一分支（图3）。

图3 根据PEDV M基因序列绘制系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on the sequence of PEDV M gene

2.4 M蛋白二级结构和抗原表位的预测

对PEDV D1株M蛋白来说，Garnier-Robson法计算出特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性结果是α-螺旋区域有9个区段，β-折叠区域有18个区段。用Chou-Fasman法预测的结果为α-螺旋区域有1个区段，β-折叠区域有12个区段。用Karplus-Schulz法预测蛋白质骨架区的柔韧性表明：有12个区域为柔韧区域。用Jameson-Wolf法预测M蛋白潜在的抗原决定簇，结果显示：1—10位、18—21位、105—124位和185—228位这几个区段的抗原指数较高。对PEDV D3株M蛋白来说，Garnier-Robson法计算出特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性结果是α-螺旋区域有8个区段，β-折叠区域有14个区段。用Chou-Fasman法预测的结果为没有α-螺旋区域，有7个β-折叠区域。用 Karplus-Schulz法预测蛋白质骨架区的柔韧性表明：有8个区域为柔韧区域。用Jameson-Wolf法预测M蛋白潜在的抗原决定簇，结果显示：1—17位、102—118位和182—223位这几个区段的抗原指数较高。对PEDV CV777参考株M蛋白来说，Garnier-Robson法计算出特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性结果是α-螺旋区域有10个区段，β-折叠区域有17个区段。用Chou-Fasman法预测的结果是α-螺旋区域有1个区段，β-折叠区域有11个区段。用Karplus-Schulz法预测蛋白质骨架区的柔韧性表明：有12个区域为柔韧区域。用Jameson-Wolf法预测M蛋白潜在的抗原决定簇，结果显示：1—17位、102—118位和182—223位这几个区段的抗原指数较高。

2.5 M蛋白抗原位点在线预测

运用在线软件（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）预测可能存在的抗原位点，结果表明：PEDV D1株M蛋白的抗原位点预测分析出7个抗原决定簇，平均抗原倾向为1.0617，其极可能的抗原位点氨基酸残基为4—17位、26—103位、120—126位、132—177位、179—189位、199—205位和208—225位；PEDV D3株M蛋白的抗原位点预测分析出7个抗原决定簇，平均抗原倾向为1.0633，其极可能的抗原位点氨基酸残基为4—14位、22—99位、116—122位、125—173位、175—185位、195—201位和204—222位；PEDV CV777株M蛋白的抗原位点预测分析出7个抗原决定簇，平均抗原倾向为1.0628，其极可能的抗原位点氨基酸残基为4—13位、22—99位、116—122位、125—173位、175—185位、195—201位和204—221位。

3 讨论

自1982年我国首次分离到PEDV后，一些省份或地区陆续有报道 PEDV的感染与发病，PED已经成为我国养猪业主要的传染病之一。从2010年末到现在，PEDV一直持续在我国猪群中流行，导致大量的新生仔猪发病死亡，因此该病的流行引起了人们的广泛关注［6］。从不同省市采集的样品检测结果显示，有些省份PEDV感染率极高，即使未发病猪场也有PEDV的潜在感染［7］。虽然PEDV只有一种血清型，但分子生物学分析表明PEDV的基因组存在基因多样性。本课题组获得了2株中国PEDV毒株的M基因全序列，测序结果显示：与经典株CV777相比，D1株M基因存在12个核苷酸的插入TTATGCTAGTAC（35—46），3个核苷酸的突变（C198T、T388C、C448T），导致蛋白存在4氨基酸（MLVL）的插入（13—16），2个位点的氨基酸发生改变（C134R、L154F）；D3株M基因存在12个核苷酸的突变（G37C、T125C、G180A、C198T、C213T、C222T、C234T、T285C、T348A、A603C、T618C、G640T），导致 3个位点的氨基酸发生改变（E13Q、V42A、A214S）。系统发育树结果表明：流行毒株D1与参考株 EAS1、SM98、CHM2013分离株亲缘性较近，流行毒株D3与参考株PEDV-LY、PEDV-WS、CH22分离株亲缘性较近，而均与参考株CV777和早期分离株JS2008的亲缘关系较远。上述研究结果与吴玉璐等［8］、卢冰霞等［9］、黄冬妮等［10］的研究结论一致。另外，本试验发现PEDV D1与D3株核苷酸的插入或突变对M蛋白的二级结构产生了明显的影响，特别是PEDV D1株的抗原性位点也发生了重要变化，这可能是导致经典疫苗株免疫效果不理想的原因之一，这就给PEDV的研究和防控指明了方向。未来的工作更需重视研究PEDV的变异及其对致病力和免疫效果的影响，为新一代PEDV疫苗的研究提供依据。

［1］LEE C.Porcine epidemic diarrhea virus：An emerging and re-emerging epizootic swine virus［J］.Virology Journal，2015，12：193.

［2］WANG E，GUO D，LIC，et al.Molecular Characterization of the ORF3 and S1 Genes of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Non S-INDEL Strains in Seven Regions of China，2015［J］.PLoSONE，2016，11（8）：e0160561.

［3］SU Y，LIU Y，CHEN Y，et al.Detection and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus in central China based on the ORF3 gene and the S1 gene［J］.Virol J，2016，13（1）：192.

［4］LIZ L，ZHU L，MA JY，et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）field strains in south China［J］.Virus Genes，2012，45（1）：181-185.

［5］CHANG SH，BAE J L，KANG T J，et al.Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus［J］.Mol Cells，2002，14（2）：295-299.

［6］朱迪国，宋建德，袁丽萍，等.2013—2014年全球猪流行性腹泻重大疫情分析［J］.中国动物检疫，2014，31（10）：42-46.

［7］张志，董雅琴，刘爽，等.我国部分省份猪流行性腹泻的流行病学监测［J］.中国动物检疫，2014，31（10）：47-51.

［8］吴玉璐，虞凌雪，程群，等.猪流行性腹泻病毒 M基因的表达及鉴定［J］.中国动物传染病学报，2012，20（6）：6-10.

［9］卢冰霞，秦毅斌，何颖，等.2011—2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其 M基因的序列分析［J］.中国畜牧兽医，2015，42（3）：549-557.

［10］黄冬妮，黄良宗，马春全，等.广东省猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析［J］.黑龙江畜牧兽医，2015（5）：136-139.