microRNA-7对人肝癌细胞MHCC-97H上皮间质转化的影响及作用机制

张传海，桂 阳*，郭凤林，马金良，余继海

microRNA是一类约22个碱基的小分子非编码RNA，对细胞的增殖、分化具有重要的调控作用，已成为近年来医学研究的热点。microRNA通常与下游靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)结合，从而促使靶基因降解或抑制其翻译，尤其在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色[1-2]。肝癌以其恶性程度高、转移性强成为临床治疗当中的难题，尤其是其转移机制目前还不是十分清楚。该课题旨在通过研究miR-7对肝癌细胞株MHCC-97H细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影响及作用机制，为深入探讨其在肝癌中的作用奠定基础，为进一步阐明肝癌的发生、转移机制及临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料肝癌细胞株MHCC-97购自中国科学院上海细胞库；pRL-TK载体购自上海林渊生物科技有限公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、Real-time PCR试剂购自北京天根生化科技有限公司；RPMI1640细胞培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；GAPDH、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、β-链蛋白(β-catenin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)抗体购自美国Santa Cruz公司；表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)、p-EGFR抗体购自美国Bioworld公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；PCR引物购自美国Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 MHCC-97H细胞快速复苏后，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，使用完全培养基制成单细胞悬液，接种于细胞培养瓶，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。隔天换液、观察细胞生长状况，当细胞汇合度约为90%时，进行消化、传代、种板，按1×105/孔接种于6孔细胞培养板。继续培养细胞至汇合度为80%时，将培养基更换为无血清RPMI 1640培养基，进行后续实验。

1.2.2载体构建 miR-7真核载体(GV268/miR-7)、野生型和突变型EGFR 3’-UTR荧光素酶载体(GV272/ EGFR 3’-UTR wt和GV272/ EGFR 3’-UTR mu)，均由上海吉凯基因化学技术有限公司构建，经鉴定证实构建成功。

1.2.3细胞转染 当细胞汇合度约为90%时，进行消化、计数，按1×105/孔接种于24孔细胞培养板。继续培养细胞至汇合度为80%时，更换培养基为无血清、无抗生素培养基，使用Lipofectamine 2000并参考其说明书进行细胞转染。

1.2.4Real-time PCR 预冷的PBS洗涤细胞3次，参照RNA和microRNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA和microRNA。以总RNA和microRNA为模板，参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA第一链。以cDNA为模板，使用ABI7500 Real-time PCR仪检测相关基因的表达。MiR-7和U6引物序列分别为：上游引物 ：5′-TGGAAGACTAGTGATT-3′和上游引物：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物为通用引物；Real-time PCR反应程序为：95 ℃、15 min；95 ℃、20 s；60 ℃、34 s，以U6为内参，采用2-ΔΔCt法比较分析miR-7表达。E-cadherin上游引物：5′-TCGCTTACACCATCCTCAGC-3′， 下游引物：5′-GGAAACTCTCTCGGTCCAGC-3′；β-catenin上游引物：5′-ACCACAAGCAGAGTGCTGAA-3′， 下游引物：5′-GCTTGCATTCCACCAGCTTC-3′；N-cadherin上游引物：5′-AACAGCAACGACGGGTTAGT-3′， 下游引物：5′-CAGACACGGTTGCAGTTGAC-3′；Vimentin上游引物：5′-AGGCGAGGAGAGCAGGATTT-3′， 下游引物：5′-AGTGGGTATCAACCAGAGGGA-3′；EGFR上游引物：5′-CGAATGGGCCTAAGATCCCG-3′，下游引物：5′-AGCTTGGTTGGGAGCTTCTC-3′；GAPDH上游引物：5′-GCCGCATCTTCTTTTGCGTC-3′，下游引物：5′-TACGACCAAATCCGTTGACTCC-3′；Real-time PCR反应程序为：95 ℃、15 s；60 ℃、1 min，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法比较分析各基因表达。

1.2.5Western blot RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法定量后，按50 μg/孔的量加样、电泳、转膜。转膜结束后，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，TBST洗膜3 min。各蛋白抗体分别参考抗体说明书进行操作，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。相应二抗室温孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL发光、显影，以GAPDH为内参，分析各指标的相对表达量。

1.2.6双荧光素酶报告基因实验 将H293T细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于24孔板中，当80%的细胞融合时，利用Lipofectamine 2000共转染(含有GV268/miR-7+野生型或突变型GV272/EGFR 3’UTR)细胞，常规培养24 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操作，以海肾荧光素酶载体(pRL-TK)作为参照，化学发光仪检测、分析各组萤火虫荧光素酶活性变化，判定miR-7是否与EGFR 3’UTR结合。

1.2.7细胞划痕 取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后，加入RPMI 1640培养基重悬为单细胞悬液。细胞计数板计数，以1×106/孔种入12孔细胞培养板，培养箱中过夜培养。待细胞长成单层即弃去培养液，用ø 1.0 μm的划痕器在每孔中央划出一划痕，无菌PBS洗去脱落细胞，100倍光学显微镜下拍照，即为0 h。然后将细胞置于培养箱中分别继续培养24、48 h后，在同一观察点处进行拍照、记录细胞生长情况。利用Image Pro Plus 6.0软件测量每孔多个点划痕间距，取平均值，计算迁移率，即细胞迁移率(%)=(划痕宽度0 h-划痕宽度24 h/48 h)/划痕宽度0 h×100%。

1.2.8Transwell实验 胰酶消化细胞后，用无血清DMEM培养基重悬、调整细胞浓度，以每孔1×104个的细胞密度加入到预铺好Matrigel基质胶的Transwell小室的上室内，下室加入500 ml完全培养液，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。取出上室，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色1 min，蒸馏水清洗3次，每次3 min。以正常组作为对照，200倍光学显微镜下观察、计数穿膜细胞数，随机选取5个视野。

1.3实验分组本研究共分为2部分，第一部分miR-7对MHCC-97H细胞EMT的影响，分组为正常组、转染GV268组和转染GV268/miR-7组，分别标记为Normal、GV268和GV268/miR-7；第二部分为miR-7对EGFR 3’-UTR及EGFR表达的影响，分组为正常组、转染GV272/EGFR 3’-UTR wt和GV272/EGFR 3’-UTR mu组，分别标记为Normal、GV272/EGFR 3’-UTR wt和GV272/EGFR 3’-UTR mu。

2 结果

2.1载体构建结果经测序鉴定GV268/miR-7、GV272/ EGFR 3’-UTR wt和GV272/ EGFR 3’-UTR mu序列均与设计序列一致，无碱基突变，表明构建成功。见图1。

2.2miR-7对MHCC-97细胞侵袭能力的影响Transwell结果显示，与Normal组相比，GV268/miR-7组细胞失去MHCC-97H细胞的基本形态，呈不规则形，且穿透基底膜的细胞数量显著下降(F=2.595，P=0.000)，细胞侵袭能力为正常组的(41.82±11.28)%。见图2。

图1 载体测序比对结果

2.3miR-7对MHCC-97细胞迁移能力的影响与Normal组相比，GV268/miR-7组细胞24、48 h的迁移能力均显著降低，差异有统计学意义(F=2.082、2.790，P=0.002、0.000)，其迁移力分别降低(32.19±9.15)%和(45.67±10.07)%。见图3。

2.4miR-7对EMT相关标识蛋白的影响Real-time PCR和Western blot分析结果显示，与正常组相比，转染GV268/miR-7组E-cadherin mRNA和蛋白表达显著升高(F=12.740、1.241，P=0.000、0.001)，β-catenin mRNA和蛋白表达显著升高(F=55.870、1.550，P=0.000、0.000)，N-cadherin mRNA和蛋白表达明显降低(F=30.570、1.257，P=0.000、0.001)，Vimentin mRNA和蛋白表达明显降低(F=42.710、3.600，P=0.000、0.000)。见图4。

图2 miR-7对MHCC-97细胞侵袭能力的影响

A：不同组别细胞穿透Transwell小室的苏木精染色结果(×200)；B：不同组别穿透Transwell小室的细胞数量；C：不同组别细胞侵袭能力比较分析；与Normal组比较：**P<0.01

图3 miR-7对MHCC-97细胞迁移能力的影响

A：细胞划痕检测不同组别细胞的迁移情况(×100)；B：不同组别细胞迁移能力的比较分析；与Normal组比较：**P<0.01

2.5miR-7对EGFR和p-EGFR表达的影响与Normal组相比，GV268/miR-7组EGFR mRNA和蛋白表达均显著下降(F=4.602、2.196，P=0.000、0.002)，p-EGFR蛋白表达也显著降低(F=3.707，P=0.003)表明miR-7可抑制EGFR和p-EGFR的表达。见图5。

2.6miR-7对EGFR3’-UTR活性的影响双荧光素酶活性检测分析结果显示：与GV268/miR-7+GV272相比，GV268/miR-7+GV272/EGFR 3’-UTRwt组荧光素酶活性显著降低(F=1.690，P=0.000)，而GV268/miR-7+GV272/EGFR 3’-UTR mu组荧光素酶活性无明显变化，表明miR-7与EGFR 3’-UTR区域存在结合位点，且二者可以结合，结合位点位于EGFR 3’-UTR区域内，序列为：GTCTTCCA。见图6。

3 讨论

肝癌以恶性程度高、转移能力强、预后差成为了临床治疗的难题，而如何降低肝癌转移能力成为急需解决的问题。近年来的研究[3]表明，EMT与肝癌细胞的侵袭、迁移关系密切，并且课题组前期的研究[4]也已经证实。EMT是指上皮细胞的生物过程通过特定程序转化成间质细胞，其在胚胎发育、慢性炎症反应、癌症转移发挥着关键作用[5-7]。EMT发生的主要标志为上皮标志物E-cadherin和β-catenin的减少和间质标记物E-cadherin和β-catenin的增加[8-10]。其通过表达更具有侵入性的蛋白酶，减弱肿瘤细胞间的黏附能力，使得肿瘤细胞具有运动活性，增加远处转移能力和形成转移灶。据报道[11-12]，一些miRNA如miR-7、miR-200、miR-429、miR-141可以促进或抑制癌症转移和通过调节EMT的侵袭。

图4 miR-7对MHCC-97H细胞EMT标识基因表达的影响

A：miR-7对EMT标识基因mRNA表达水平的影响；B：Western blot检测miR-7对EMT标识蛋白表达的影响；C：miR-7对EMT标识蛋白表达水平的影响；与Normal组比较：**P<0.01

图5 miR-7对EGFR和p-EGFR表达的影响

A：miR-7对EGFR mRNA表达水平的影响；B：Western blot检测miR-7对EGFR和p-EGFR蛋白的影响；C：miR-7对EGFR和p-EGFR蛋白表达影响的分析；与Normal组比较：**P<0.01

图6 miR-7对EGFR 3’-UTR萤火虫荧光素酶活性的影响

1：转染GV272组；2：转染GV272+GV268/miR-7组；3：转染GV268+GV272/EGFR 3’-UTR wt组；4：转染GV268+GV272/EGFR 3’-UTR mu组；5：转染GV268/miR-7+GV272/EGFR 3’-UTR wt组；6：转染GV268/miR-7+GV272/EGFR 3’-UTR mu组；与转染GV268+GV272/EGFR 3’-UTR wt组比较：**P<0.01；与转染GV268/miR-7+GV272/EGFR 3’-UTR mu组比较：##P<0.01

miR-7作为肿瘤抑制性微小RNA首先在胶质母细胞瘤中被鉴定出来，其可通过靶向调控PAK1和EGFR信号通路抑制胶质母细胞瘤生长和侵袭[13-14]。研究[15-16]表明，miR-7在乳腺、舌、胃、肺和肝等肿瘤组织中下调。虽然许多研究[17-18]报道了miR-7的作用，但是其对肝癌细胞EMT的影响及作用机制研究的较少。因此，本研究运用Real-time PCR、Western blot和免疫组化，验证了过表达miR-7可降低MHCC-97H细胞的侵袭、迁移能力，提高上皮标识蛋白E-cadherin和β-catenin的表达，降低间质标识蛋白N-cadherin和Vimentin的表达，进而抑制MHCC-97H细胞EMT。

EGFR具有酪氨酸激酶受体家族的基本生物学功能，包括调控细胞活性、增殖、迁移和分化等，EGFR突变或过表达与肿瘤的发生发展有着密切联系[19]。本研究运用生物信息学预测，通过构建双荧光素酶报告基因载体，证明了miR-7可直接靶向调控EGFR，抑制EGFR及p-EGFR表达，进而降低MHCC-97H细胞的侵袭、迁移能力，初步阐明了miR-7调控MHCC-97细胞EMT的作用机制，为深入研究其对MHCC-97细胞的影响奠定了基础。然而，由于miR-7作用途径的多样性，后期本研究将通过更加深入、广泛的研究，进一步阐述其在肝癌中的生物学功能。

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