RP-HPLC法测定红要子中大黄素的含量

宋若冰 张惠霞 董玉珍

红要子为蓼科植物翼蓼Pteroxygonum giraldii Drammer et Diels.的干燥块茎[1]。具有清热解毒，凉血止血，收敛之功效。用于胃肠炎，菌痢、扁桃体炎，月经不调，功能性子宫出血等。外用治外伤出血，烫火伤、痈疔等[2]。《中药大辞典》（第二版）下册收载本品名称为“荞麦七”，分布于河北、山西、河南、四川、陕西、甘肃等地，含蒽醌类（大黄素、大黄素甲醚），鞣质等化学成分。其中大黄素具有抑菌、抗炎、保护肝肾、抑制血小板聚集、改善微循环、抗癌等多种药理作用[3]。本研究首次建立高效液相色谱法测定红要子中大黄素的含量，为红要子的进一步开发利用提供参考，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；METTLER TOLEDO电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司，0.01 mg）；KQ-500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅；大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，含量测定用，含量以98.7%计，批号：110756-201512）；甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯；红要子（河南省世通医药有限公司，选装，每袋装0.2 kg，产地：河南，批号：160415，160416，160417）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent C18（5μm，4.6×250 mm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液 （80∶20），流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温为30℃[4]。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品10.86 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度0.1072 mg·mL-1的对照品储备溶液。再取储备液1 mL置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为4.29μg·mL-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，置具塞锥形瓶中，水浴蒸干，加8%盐酸溶液20 mL，超声处理（功率100 W，频率40 kHz） 5 min，加三氯甲烷20 mL，水浴中加热回流1 h，取出，立即冷却，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，酸液再用三氯甲烷液提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[4-5]。

2.4 系统性试验 按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪中，记录色谱峰。结果在对照品色谱峰保留时间对应的位置上，供试品溶液有色谱峰，理论板数按特大黄素峰计大于4000，分离度大于1.5，见图1。

图1 红要子高效液相色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密量取“2.2”项下浓度0.1072 mg·mL-1的对照品储备溶液适量，配制浓度为1.07、2.14、4.29、8.58、12.86 μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以浓度（μg·mL-1）为横坐标，峰面积（mAU*s）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=77.28X+1.35，R=0.9999。结果表明大黄素在1.07～12.86μg·mL-1范围内线性良好。

2.5.2 精密度试验精密吸取“2.2”项下浓度为4.29μg·mL-1大黄素对照品溶液10μL，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，RSD为0.15%，说明仪器精密度良好。2.5.3重复性试验 取红要子样品，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样10μL，记录峰面积，计算含量，结果RSD为0.37%，说明重复性较好。

2.5.4 稳定性试验 精密吸取供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10 h按“2.1”项下色谱条件进样10μL，记录峰面积，计算RSD为0.11%，表明溶液在10 h内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验 取已知含量的样品（批号：160415）9份，每份2 g，精密称定，分成3组，每组3份，每组分别加入“2.2”项下浓度为4.29μg·mL-1大黄素对照品溶液3 mL、5 mL、7 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别吸取10μL注入液相色谱仪，记录峰面积，计算回收率，结果平均回收率均大于95%，RSD＜1.0%（n=3），符合定量分析的要求，测定结果见表2。

表2 加样回收率试验 (n=3)

2.6 供试品含量测定 取红要子样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取“2.2”项下浓度为4.29μg·mL-1大黄素对照品溶液、供试品溶液各10μL，按照“2.1”项下色谱条件注入液相色谱仪，记录峰面积，以外标一点法计算供试品中大黄素含量，结果见表3。

表3 含量测定结果 (n=3)

3 讨论

（1） 色谱条件的选择参考《中华人民共和国药典》 2015年版一部大黄含量测定项下色谱条件及相关文献[4-5]，选择甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相，以不同比例进行调试，采用甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20） 为流动相，所得大黄素色谱峰的理论板数高、峰对称性均较好，故选择其作为流动相。采用紫外分光光度计对大黄素对照品溶液于200～400 nm波长范围内扫描，结果在254 nm波长处有最大吸收，故选择254 nm作为检测波长。（2）本方法简便快速、结果准确、重现性好，为红要子药材资源的开发利用提供了一定的参考依据。

[1]河南省卫生厅.河南省中药材标准（二）[S].郑州：中原农民出版社，1993：43.

[2]河南省食品药品监督管理局.河南省中药饮片炮制规范[S].郑州：河南人民出版社，2005：65.

[3]张喜平，李宗芳.大黄素的药理作用研究概况[J].中国药理学通报，2003，19（8）：851-854.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：176.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：23.