大鼠无创伤气管插管心肌缺血再灌注损伤实验的探索与实践

刘 芬，张大威，吕文伟，李一帆，张志刚*

（1.吉林大学基础医学院机能实验中心，长春 130021；2.长春中医药大学解剖教研室，长春 130117）

医学是一门实践性较强的学科，实验教学是整个医学教育的重要组成部分，是整个教学过程中不可缺少的教学形式，在医学教育中占有重要的地位[1-2]。机能实验学是医学的一门重要的实验学科，它不仅仅是指导学生通过实验验证理论知识，而更重要的是培养学生创新能力、科研思维、临床实践能力的重要手段[3-4]。随着医学实验教学改革的不断深入，新的教学模式、教学手段、课程体系不断脱颖而出[5]。大鼠心肌缺血再灌注实验作为现代较前沿的科研方法也引入了机能实验教学的课堂，旨在培养厚基础、高素质、强能力的新型医学人才。目前，心肌缺血疾病呈上升趋势，特别是急性心肌梗死患者死亡率高，严重危及人民的身体健康。近年来，随着医疗水平和技术的发展，溶栓疗法应用急性心肌梗死治疗，但如何去减轻病人的缺血再灌注损伤，最大可能地挽救心肌、保护心肌细胞功能一直是广大医务工作者奋斗目标[6-7]。所以成功建立可靠的心肌缺血再灌注损伤模型及其机制研究至关主要。大鼠心肌缺血再灌注损伤实验是机能学开展的一项心血管系统综合性实验，学生从大鼠麻醉、手术、正常生理指标观察、模型制备、给药治疗，到取心脏染色、照相、心肌梗死面积测定，取血、测量心肌三酶指标均自行操作，学生通过实验全面观察器官系统由正常生理状态到疾病状态再到疾病转归或回复正常的全过程。调动了学生的积极性和实验兴趣，培养了学生的动手能力和团队协作精神。

1 目前实验操作存在的问题

结扎大鼠左冠状动脉前降支（LAD）形成心肌缺血、梗死是目前国内外公认的模型制备方法[8-11]，该实验需在呼吸机支持下结扎大鼠左冠状动脉，缺血30 min 后再灌2 h 制备缺血再灌模型。大鼠常规麻醉、颈部剪毛、切开皮肤、剥离皮下组织、钝性分离颈部各层肌肉、暴露气管、剪开气管行气管插管，连接呼吸机，见图1（见插页四）。由于大鼠颈部手术视野小，对初次操作的学生来说有一定难度，容易造成出血和窒息死亡，大鼠成活率低，观察不到最终结果，导致实验失败。这种传统气管插管方法需剪开气管，损伤性大，也不适合慢性再灌注的实验观察[12-14]。同时，该模型的传统心肌切片染色方法是在空气中直接拍照，图片不清晰，梗死面积的测定误差很大，严重影响实验结果。本研究结合实验室实际情况和条件，充分利用实验室资源，反复探索操作技巧，对实验的某些环节和步骤进行改进和完善，降低操作的难度，使学生更加容易掌握相关操作技术，提高实验成功率，可在有限的课堂时间内完成教学任务，推动实验教学改革。

2 大鼠无创伤气管插管方法改良

用小鼠灌胃针和乳胶管自制大鼠无创伤气管插管，见图2（见插页四），插管方法如下：将固定大鼠的鼠板头端抬高，左手用纱布将大鼠的舌向左嘴角外上方牵拉出口腔，用手电筒直接照射大鼠颈部前方,经口腔直视下可见大鼠喉腔内有一透亮区[15-16]，清晰可见大鼠声门裂随着呼吸开启与闭合，在声门裂打开瞬间迅速将自制气管插管通过喉腔插入气管。该操作方法主要优势：1）大鼠无需颈部手术，无创伤气管插管经口腔、喉腔插入气管与小动物呼吸机相连，简化手术步骤，降低手术难度。2）用小鼠灌胃针自制的无创伤气管插管实用性强，简单易行，学生容易掌握，而且灌胃针头部圆润光滑，对大鼠气管内膜无损伤，可反复多次操作。3）手术大鼠可长期饲养，有利于慢性再灌注的实验观察。学生通过两个实验操作组进行实践比较，在传统组有创伤气管插管操作中，10只大鼠有3只因分离气管和插管时出血或窒息死亡；在改革组用自制的无创伤气管插管操作中，10只大鼠均未出现气管插管死亡，实验操作全部成功。通过本实验方法的改进，降低了实验操作难度，极大的提高了实验大鼠成活率及实验教学效果。

3 心肌拍照及梗死面积测量方法改进

心肌梗死面积的测量是大鼠心肌缺血及缺血再灌注损伤实验的一个重要指标[17]，而心肌照片的好坏是心肌梗死面积的准确测量的前提。为了提高照片的清晰度及准确度，本研究对心肌拍照方法进行了改进，步骤如下：1）心肌切片（厚度约1 mm左右）TTC染色后先放入5%的福尔马林中固定，防止染色后的心肌暴露在空气中氧化导致颜色加深。2）将染色的心肌切片放入盛有蒸馏水的特定器皿中，水的深度刚好高于心肌切片的厚度，使染色后的心肌切片保持清晰，色彩鲜艳，且与空气隔离，进一步防止染色后心肌的氧化。3）应用BI-2000图像分析系统进行心肌梗死面积的测量及统计，实验结果准确可靠（见图3、图4）（见插页四）。此方法已经推广应用到大鼠脑缺血及再灌注实验中，取得了非常好的效果。

4 结语

随着机能实验教学改革的深化，本课题组人员非常重视实验方法和操作技术的革新，通过多年的实验教学经验积累和操作技术的摸索，创新性的研究出大鼠无创伤气管插管心肌缺血再灌注损伤实验方法，避免了创伤气管插管对大鼠的损伤，极大的提高了模型大鼠成活率和实验成功率。该实验操作方法简单，容易掌握，实用性强，学生在实验教学和相关科研中取得了满意的效果[18]。该实验的有效开展为基础实验教学与临床科研实际相结合奠定了良好的实验基础，有利于学生早期接触临床科学研究，接受科研熏陶，提高分析问题、解决问题的能力[19-20]。同时，本研究提出的改良后的拍照方法及BI-2000图像分析系统的应用，极大的提高了照片的清晰度及准确性，减小了实验误差。