多烯紫杉醇不敏感肺腺癌患者癌组织HDAC1、miR-200b表达及其意义

陈东芹，姜敏，陶敏，陈龙邦

(1苏州大学附属第一医院，江苏苏州215006；2南京军区南京总医院)

根据病理类型的不同，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，高达85%的肺癌为非小细胞肺癌，其中肺腺癌为非小细胞肺癌的主要病理类型[1，2]。多烯紫杉醇是治疗肺腺癌的重要药物,多用于肺腺癌术后辅助化疗，但近年来多烯紫杉醇耐药的发生率明显提高。微小RNA-200b(miR-200b)是miR-200家族的重要成员。miR-200家族成员在多种肿瘤细胞和组织中呈显著低表达，并发挥抑癌基因作用。我们前期利用高通量芯片技术分析了人肺腺癌亲本细胞与耐药细胞之间miRNAs表达差异，发现miR-200b在耐药肺腺癌细胞中表达水平下调。组蛋白去乙酰化酶(HDACs)通过移除组蛋白(或非组蛋白)赖氨酸残基的乙酰基，形成相对封闭的染色质构象，抑制DNA的转录。我们前期研究发现下调组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)表达后，miR-200b的表达明显上调，提示HDAC1、miR-200b共同参与了体外培养的肺腺癌细胞耐药。本研究观察了肺腺癌组织HDAC1 mRNA、miR-200b表达变化，探讨HDAC1 mRNA表达与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2006年1月～2007年12月收治的肺腺癌患者72例。纳入标准：①接受手术治疗，有肿瘤组织标本留存。②术后病理证实为原发肺腺癌。③临床分期为中晚期(Ⅲb～Ⅳ期)。④术后接受含多烯紫杉醇75 mg/m2的化疗方案化疗3个周期。纳入患者男51例、女21例，年龄45～71岁，平均62岁，Ⅲb期25例、Ⅳ期47例。化疗完成后均行CT检查，按RECIST标准评价疗效，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD)，CR、PR为对多烯紫杉醇敏感。本组患者对多烯紫杉醇敏感32例(敏感组)，不敏感40例(不敏感组)。

1.2 癌组织HDAC1 mRNA、miR-200b检测 收集两组患者留存的肿瘤组织标本，用TRIzol法提取总RNA，逆转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测HDAC1 mRNA、miR-200b表达。①HDAC1 mRNA：以GAPDH为内参照。HDAC1 mRNA正向引物5′-TAACCTGCCTATGCTGATGCT-3′,反向引物5′-CTCATTCGTGTTCTGGTTAGTCATA-3′；GAPDH正向引物5′-TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′，反向引物5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min,95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s，共进行35个循环。②miR-200b：以U6位内参照。miR-200b正向引物5′-GTGGAGGGTCCGAGGTATTC-3′，反向引物5′-CGTAATACTGCCTGGTAATGATG-3′；U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s，共进行40个循环。以2-ΔΔCt表示HDAC1 mRNA、miR-200b相对表达量。 绘制肺腺癌组织HDAC1 mRNA、miR-200b相对表达量预测多烯紫杉醇敏感性的受试者工作特征(ROC)曲线，用最大约登指数法确定截断值。HDAC1 mRNA、miR-200b相对表达量大于或等于截断值定为高表达，否则为低表达。

1.3 HDAC1 mRNA与miR-200b表达的相关性 采用Spearman法分析HDAC1 mRNA与miR-200b表达的相关性。

1.4 HDAC1 mRNA、miR-200b高表达和低表达者1年无进展生存率 采用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验比较HDAC1 mRNA、miR-200b高表达和低表达者1年无进展生存率。

2 结果

2.1 两组HDAC1 mRNA、miR-200b相对表达量比较 敏感组、不敏感组HDAC1 mRNA相对表达量分别为0.76±0.12、1.23±0.35， miR-200b相对表达量分别为1.25±0.30、0.80±0.14，两组相比P均<0.05。癌组织HDAC1 mRNA预测多烯紫杉醇敏感性的ROC曲线下面积为0.681，截断值为0.86；癌组织miR-200b预测多烯紫杉醇敏感性的ROC曲线下面积为0.773，截断值为0.79。72例患者HDAC1 mRNA高表达26例、低表达46例，miR-200b高表达41例、低表达31例。

2.2 癌组织HDAC1 mRNA表达与miR-200b表达的相关性 72例患者癌组织HDAC1 mRNA表达与miR-200b表达呈负相关(r=-0.791,P<0.05)。

2.3 HDAC1 mRNA、miR-200b高表达和低表达患者的无进展生存率比较 HDAC1高、低表达者1年无进展生存率分别为23.07%(6/26)、60.86%(28/46)，P<0.05。miR-200b高、低表达者1年无进展生存率分别为65.85%(27/41)、22.58%(7/31)，P<0.05。

3 讨论

miRNAs是一类广泛存在的长度为20～22个核苷酸的短链RNA，是转录后调控网络中重要的调控因子，通过与靶基因mRNA 的3′-非翻译区(3′-UTR)结合，从而导致翻译抑制或脱腺苷酸化诱导的mRNA降解，从而在转录后水平调控靶基因的表达。据估计，大约有一半以上的人类蛋白编码基因受到miRNAs的调控。大量研究表明，miRNAs不但维持着细胞正常生理功能，如细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程，而且其表达紊乱也参与了多种病理生理过程，如肿瘤的发生、发展、迁徙、转移、化疗抵抗等[3，4]。miR-200b是miR-200家族的重要成员之一，该家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429共5个成员，依据定位不同可分为miR-200b/miR-200a/miR-429和miR-200c/miR-141两个基因簇，分别定位于染色体1p36.33和12p13.31位点。miR-200家族成员在多种肿瘤细胞和组织中呈现显著的低表达，并发挥抑癌基因作用，包括非小细胞肺癌、卵巢癌[5]、胃癌、乳腺癌、结直肠癌等[6～8]。我们前期利用高通量芯片技术分析了人肺腺癌亲本细胞与耐药细胞之间miRNAs表达差异，发现miR-200b在耐药人肺腺癌细胞中表达显著下调，上调miR-200b表达可显著逆转人肺腺癌细胞耐药性。本研究结果显示，不敏感组患者肿瘤组织miR-200b低于敏感组，与之前对人肺腺癌细胞的体外研究结果相符。表明miR-200b表达下降与肺腺癌患者的多烯紫杉醇耐药有关。

本课题组前期研究发现，干扰HDAC1后人肺腺癌耐药株中miR-200b的表达明显上升，表明肺腺癌耐药株中HDAC1与miR-200b是密切相关的，故本研究中笔者尝试从组蛋白乙酰化/去乙酰化途径解释miR-200b表达下降参与肺腺癌DTX耐药的机制。组蛋白乙酰化/去乙酰化途径的主要效应蛋白是组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)。HDACs通过移除组蛋白(或非组蛋白)赖氨酸残基的乙酰基，形成相对封闭的染色质构象，抑制靶DNA的转录[9，10]。HDACs在多种肿瘤中高表达，在肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、前列腺癌患者中，高表达的HDACs与患者预后不良相关[11，12]。本研究结果显示，不敏感组肺腺癌者肿瘤组织miR-200b表达高于敏感组，肺腺癌患者HDAC1 mRNA相对表达量与miR-200b相对表达量呈负相关，表明组蛋白乙酰化/去乙酰化途径参与了miR-200b表达下降参与肺腺癌多烯紫杉醇耐药的机制，miR-200b表达下降可能会导致肺腺癌组织HDAC1表达升高，对靶基因转录的抑制作用减弱，靶基因转录水平升高而出现多烯紫杉醇耐药，但具体是哪些靶基因参与了这一过程尚需进一步研究。本研究结果显示，HDAC1低表达患者1年无进展生存率高于高表达者，miR-200b低表达患者1年无进展生存率低于低表达者，提示HDAC1高表达、miR-200b低表达肺腺癌患者的预后不良，可能原因是此类患者易出现DTX耐药。

综上所述，多烯紫杉醇不敏感的肺腺癌患者肿瘤组织HDAC1高表达、miR-200b低表达。检测肺腺癌组织HDAC1、miR-200b表达有助于预测肺腺癌患者对多烯紫杉醇的敏感性和预后。

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