小麦花药培养各种影响因子的研究进展

董艳辉，赵兴华，李亚莉，王亦学，任永康，王长彪，唐朝晖

（1.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西 太原 030031；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西 太原 030031）

花药培养是获得小麦加倍单倍体植株的重要途径之一，也是生物技术育种中较为成熟的技术之一，其产生的后代是进行遗传育种研究和培育新品种的优良材料。小麦花药培养自20世纪70年代开始获得花药培养植株以来，在理论和应用研究方面取得了长足的发展，其技术体系已经相对比较完善和成熟，已经成为小麦常规育种技术的重要补充。科研人员利用该技术已经获得豫麦37号、豫麦60号、京花1号、花培764、花培1号、京花10号、花培3号、花培5号、花培6号、奎花1号、陕农28等小麦新品种，其中，花培5号为河南省农业科学院2006年审定的国审品种。多年来，国内外的科研工作者围绕小麦花药培养关键技术开展了多方面研究，诸如，基因型、培养基成分、预处理、染色体加倍等。研究表明，小麦花药培养还受上述诸多因素的限制。

笔者综述了小麦花药培养的关键技术，讨论了不同影响因子的最新研究进展，以期为提高小麦花药培养效率提供参考。

1 基因型

小麦花药培养受各种因子的影响，如基因型、培养基成分以及培养条件等，其中，基因型是影响花药培养效率诸多因素中主要的影响因素。TORP等[1-2]研究表明，多种遗传效应影响小麦花药的培养力，表现为多基因控制的数量性状遗传，包括显性效应、互作效应、胞质效应、加性效应和核质互作效应等。任慧莉等[3]研究表明，相同培养条件下，不同基因型小麦花药培养一步成苗的愈伤组织诱导率、绿苗分化率、白苗分化率及绿苗产量等也不同。蔡正云等[4]研究认为，小麦基因型对花培效率的影响是多方面的，基因型对绿苗分化、愈伤组织的产生、白化苗的产生都有一定程度的影响，并且基因型不同，影响的方面也不尽相同。该研究结果与任慧莉等[3]的研究结果基本一致。徐龙珠等[5]研究认为，花培中母本基因型对诱导率的影响大于父本，即存在细胞质效应，把性状优良、诱导率高的材料作为母本进行组配，可以提高杂交后代花培诱导率。吕学莲等[6]对宁春4号进行正反交的培养力试验，结果也表明，母本效应大于父本效应；同时提出利用高培养力的高产和优质桥梁基因型，在很大程度上可以提高花药培养效率。韩晓峰等[7]利用小麦花药培养力强的基因型Alondra做父本的试验结果表明，亲本中只要有一个花药培养力高，其杂交组合后代花药培养力一般都较高，表现为显性效应；但是如果亲本双方花药培养力都很高，其杂交组合后代的花药培养力反而不一定很高，表现为互作效应。

基因型对小麦花药培养的影响是可遗传的性状，因此，加强对具有优良生物学性状和培养力强的小麦基因型进行筛选作为桥梁亲本，是提高杂交后代的花药培养效率比较有效的途径之一，对进一步提升花药培养技术在小麦生物技术育种中的地位有很大的现实意义。目前，通过国内外的花培育种家们的潜心研究，已经筛选出一批农艺性状优良、花培效率高的优良小麦基因型材料，国外品种有 Verry，Lagwa，Zadra，Sumai 3，Saptdhara，Noria 73，Florida，Orofen，Chris等，国内有京东 8 号、宁春 4 号、新春9号、温6、陇春27号、周麦16号等。

2 培养基

2.1 基本培养基

小麦花药培养效率的提高，在很大程度上是依赖于培养基成分、配比以及附加成分的改变来实现的，可以说培养基的改良一直处于主导地位。经过前人的多年研究，小麦花药培养的基本培养基历经了马铃薯，N6，MS，W14，C17，K3，K（癸培养基）等[8-13]，培养效率也逐步提高，其中，目前常用的培养基主要有 W14，C17，K 培养基等。陈保峰[14]用 N6，C17，MS这3种培养基对豫麦57号、小偃22、郑麦9023等3个品种进行花药培养对比试验，结果表明，C17培养基的愈伤组织诱导率明显优于N6和MS培养基。杨雪等[15]用C17和K培养基对128个黄淮麦区杂交组合进行花药培养，结果表明，K培养基对小麦花药愈伤组织的平均诱导率较C17培养基提高了90.2%，稳定性更强，这与张再君等[16]的研究结果不太一致，可能存在供试材料基因型不一样导致对培养基的反应不同，存在着基因型与培养基的互作机制，因此，K培养基可能更适用于黄淮麦区的花药培养，进一步研究表明，K培养基中的NH4+浓度低可能是其花药培养率高的一个影响因素。吕学莲等[17]用C17和W14固体培养基对103份供试小麦材料进行花药培养，结果表明，C17培养基愈伤组织诱导率达到W14培养基的2倍，差异较大，进一步研究表明，C17培养基的绿苗分化率也高于W14培养基，而白化苗分化率方面二者差异不大。

2.2 附加成分

随着小麦花药培养技术的日益成熟，前人对小麦花药培养的影响因素的研究也进一步细化和深入，尤其是对培养基附加物的类型、含量和配比的研究及改良，大大提高了小麦花药培养率，因此，附加物成分的改变可能是花药培养效率提高的一个至关重要的突破口。目前，最常见且被广泛应用的附加物成分有2，4-D、苯乙酸（PAA）、多效唑（MET）、ABA（脱落酸）、脯氨酸、谷氨酰胺、秋水仙素以及植物器官、组织和细胞提取液等，它们对愈伤组织诱导率、绿苗分化率产生的效果已经被广泛证实，但是具体的机理还有待进一步的研究。张廷红等[18]在小麦分化培养基中加入4 mg/L AgNO3的研究表明，花药愈伤组织的分化率和绿苗率最高，组织分化率可以达到56.65%，该结果与在黄瓜中研究的结果一致。李文卓等[19]研究认为，在小麦花药培养的基本培养基C17中加入6-BA和2，4-D形成的愈伤组织，其诱导、分化以及染色体加倍率都比较高，且以2，4-D和6-BA的体积比为2∶1效果最佳。王炜等[20]研究认为，在小麦基本培养基W14中加入阿拉伯半乳糖（AGP）可以提高愈伤组织的诱导率，这与前人在植物小孢子培养过程中加入子房共培养或者加入子房提取液共培养能够提高小孢子培养率的研究结果一致。陈保峰[14]在基本培养基N6和C17中加入10%的椰子汁后，2种培养基的愈伤组织诱导率都显著提高，同时也表明，C17培养基中加入脯氨酸也能提高愈伤组织诱导率，其最佳浓度为5.0mmol/L。史勇等[21]在癸培养基中加入0.9mg/L的稀土（rare eaxth addition）后，小麦花药培养的愈伤组织诱导率大大提高，最高可达64.07%。海燕等[9，20]进一步研究表明，分化培养基中加入稀土后也可显著提高绿苗分化率，由于稀土成分比较复杂，其作用机理还有待进一步研究[10，22]。除了上述培养基附加物外，还有一部分附加物，它们对小麦花药培养的愈伤组织诱导率的影响不大，但是对绿苗的分化率有显著的提高作用，如N-苯基-N′-（2-氯 -4吡啶基）脲（4PU-30）、脱落酸（ABA）等，还有研究表明，在培养基中加入器官提取液或者用子房与花药共培养都可以显著提高花药培养愈伤组织诱导率和绿苗分化率。

3 培养条件

小麦花药培养过程中，温度和光照也是不可忽视的影响因素。吕雪莲等[17]对不同基因型小麦花药高温暗培养时间进行研究，结果表明，高温培养比不进行高温培养的愈伤诱导率高，不同基因型的高温暗培养的最适宜时间不同，还需要大量的基因型材料通过试验加以验证。欧阳俊文等[23]对小麦不同的亲本和F1进行花药培养，结果表明，培养温度受基因型的影响，并且这一特性是可以遗传的，进一步研究表明，该遗传是受多基因控制的数量性状遗传，同时认为高温培养虽然提高了小麦愈伤组织的诱导率，但是降低了绿苗分化率。倪胜利等[24]对旱作小麦花药培养试验结果表明，在培养初期32℃高温下培养10 d，可以显著提高愈伤组织诱导率。

温度和光照是影响小麦花药培养不可忽视的因素之一，因此，优化不同基因型的最佳培养温度和最适宜的光照时间可以进一步提高小麦花药培养效率，同时小麦花药接种前期的低温预处理也是影响因素之一，但是低温处理的时间因基因型的不同而稍有不同。宋运贤等[25]以10个普通小麦品种（系）和16个杂交F1作为研究对象，结果表明，小麦花药接种前低温预处理0.5 d，花药的愈伤组织诱导率和绿苗诱导率为最佳，超过8 d后低于对照。前人研究进一步表明，低温预处理时间与基因型有关，不同的基因型低温预处理的最佳时间不同。

4 讨论及展望

目前，我国利用小麦花药培养技术已经育成50多个省审乃至国审小麦品种和一大批优良的种质遗传材料，在生物技术育种技术中，小麦花药培养已成为系统的、成熟的小麦育种技术方法，利用该技术创建的小麦加倍单倍体（DH）群体在小麦分子遗传研究中发挥了重要作用，同时，通过该技术与其他育种技术相结合，如辐射诱变、转基因技术和远缘杂交等，进一步丰富了小麦遗传材料，总之，小麦花药培养充分地显示了其在小麦分子研究和育种实践中的重要利用价值。但是花培品种与常规育种品种相比，虽然也有一定数量的国审品种，但在实际生产中能够较大面积推广种植的品种还较少，没有能够充分发挥其优势。其原因是多方面的，存在显著的基因型依赖性、绿苗分化率较低、花药接种过程较为繁琐，同时，单倍体加倍率不高和与常规育种技术结合程度不高，也是限制其发展的主要因素。因此，大范围收集、筛选具有优良花培特性的小麦基因型材料是发展花药培养技术的关键所在；进一步提高花培效率，优化培养流程，重视与常规育种技术的结合，加强技术和育种材料的交流能够进一步推动花药培养技术的进一步发展；最后加强与现代分子生物学技术（分子标记辅助选择、转基因）相结合，从分子水平上提升花药培养的培养效率，提升研究水平。

随着下一代测序技术、高通量筛选突变体等现代分子生物学技术的迅猛发展，小麦加倍单倍体材料（DH）的创制就显得尤为重要。花药培养技术与诱变技术、远缘杂交等技术的相互补充，将会在加快小麦突变体、杂合体的纯合，在优良材料中筛选抗性分子标记方面发挥应有的作用。通过几十年的不懈努力，我国在小麦花药培养研究某些方面处于国际领先地位，但是存在各个领域的研究人才团队建设不合理，研究材料共享渠道不畅通等问题。因此，加强不同领域科研人员的团队建设、建立小麦优良材料种质资源库，培养具备多项知识和技术的人才队伍，这将会有力助推我国在相关领域的研究水平，使我国原本具有优势的小麦花药培养技术赶超国外。

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