Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究

耿介，王超男，李少华，丁红梅，李慧，黄皑雪，李洁，李达，白琛俊，张坦，董洁，邵宁生

军事医学研究院 军事认知与脑科学研究所，北京 100850

人vasorin（VASN）蛋白又称slit-like2（SLITL2）蛋白，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，其N端胞外结构域可以被去整合素-金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloprotease 17，ADAM17）酶解为可溶性VASN（soluble VASN，sVASN），释放至体液中[1]。已有文献报道，人VASN蛋白在主动脉的血管平滑肌细胞有较高水平的表达，在肾脏、胎盘组织也有表达，并且在乳腺癌细胞、肝癌组织及细胞中也有高表达[2]。

关于VASN蛋白的生物学功能已有报道，TGF-β能够与可溶性VASN蛋白结合，抑制TGF-β介导的上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchy⁃mal transition，EMT），提示VASN蛋白可能参与了肿瘤的发生发展[3]。而我们实验室的前期工作提示VASN蛋白可能是潜在的肝癌血清标志物[4]，并且对VASN蛋白的生物学功能进行了初步探讨。细胞中VASN蛋白有促进肝癌细胞增殖和迁移的作用[4]；而VASN蛋白存在于HepG2细胞来源的外泌体中，其可被转运至人脐静脉内皮细胞（hu⁃man umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中，对HUVEC的迁移也有促进作用[5]。基于以上结果，深入探讨VASN蛋白的生物学功能及其分子机制，对于研究肿瘤的发生机制非常有意义。因此，我们拟构建VASN基因稳定敲除的细胞株，为深入研究VASN蛋白的生物学功能奠定基础。

我们利用基因编辑技术CRISPR/Cas9，将潮霉素B的抗性基因插入VASN基因，从而破坏了VASN的读框，使VASN蛋白的表达发生异常；然后再利用潮霉素B抗性筛选获得稳定敲除VASN的HepG2细胞株；进而，利用稳定敲除VASN的HepG2细胞株研究VASN的生物学功能和分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2细胞由本室保存；表达载体pCas-guide和pSilencer2.1-U6hygro由军事医学研究院郑晓飞教授惠赠；pBackZero-T载体、平末端PCR产物加A试剂盒购自TaKaRa公司；pfu酶购自北京全式金生物技术公司；感受态大肠杆菌DH5α、T4DNA连接酶、柱式基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；限制性核酸内切酶BamHⅠ、BsmBⅠ购自Thermo Scientific公司；PRIME jet转染试剂购自PolyPlus公司；潮霉素B购自罗氏公司；VASN抗体由本室自行制备；引物由生工生物技术公司合成；CCK-8购自碧云天生物技术有限公司；2×SYBR PCR Mix（ROX）购自康为公司；TRIzol试剂购自Sigma公司。

1.2 构建pCas-gRNA质粒

运用Crispr Design程序（http://crispr.mit.edu/）设计针对VASN基因序列的指导 RNA（guide RNA，gRNA）的3对引物序列（表1），送生工公司合成。gRNA引物退火，用BamHⅠ和BsmBⅠ双酶切，将酶切的退火产物与具有相同粘性末端的载体pCas-guide连接，20℃连接4 h，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，于含氨苄西林的LB培养板上于37℃过夜培养，挑取细菌单克隆PCR鉴定，分别选取2个阳性克隆测序。

1.3 构建供体DNA质粒pBackZero-T-VASN

收集HepG2细胞，按照基因组提取试剂盒说明书提取HepG2细胞基因组；以提取的细胞基因组作为PCR模板，分别以VASN-LF/VASN-LR、VASN-RF/VASN-RR为引物，扩增VASN左、右同?源臂片段VASN-L和VASN-R；以Hy-F/Hy-R为引物，质粒pSilencer2.1-U6hygro为模板，扩增潮霉素B抗性基因片段Hy；将片段VASN-L、Hy和VASNR混合作为模板，以VASN-LF和VASN-RR为引物进行重叠PCR，扩增目的片段VASN-KO；用平末端PCR产物加A将单个碱基A加在VASN-KO片段末端，进而与pBackZero-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取细菌单克隆PCR鉴定，选取4个阳性克隆测序。

表1 合成的引物序列

1.4 细胞转染及VASN稳定敲除细胞株筛选

将HepG2细胞以1×105/mL接种于6孔细胞板中，当细胞生长至约40%时转染1 μg pCasgRNA质粒，48 h后再转染1.5 μg pBackZero-TVASN质粒；约5 d后，将转染后的HepG2细胞以6×104/mL的密度接种到100 mm2细胞培养皿中，待细胞完全贴壁后加入潮霉素B（300 μg/mL）进行抗性筛选，2～3 d换液一次；培养至第10 d在显微镜下观察细胞培养皿，可以看到已有单克隆形成，将其转移至6孔板中继续扩大培养。

无限稀释法筛选VASN稳定敲除的HepG2单克隆细胞株。胰酶消化细胞，以新鲜培养基稀释细胞浓度为10/mL，将稀释的细胞悬液接种至96孔板，100 μL/孔，培养1周后显微镜下观察，选取单克隆细胞扩大培养，扩大培养至24孔板时，培养基中加入300 μg/mL潮霉素B继续培养。

1.5 Western印迹检测VASN敲除细胞株中的VASN蛋白含量

用含潮霉素B的培养基培养1周，收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白，每泳道40 μg蛋白进行SDS-PAGE，Western印迹鉴定，一抗为本室自制的鼠源VASN抗体（终浓度1 μg/mL），4℃孵育整夜，二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG,室温孵育约1 h，ECL显影。

1.6 RT-PCR检测VASN敲除细胞株中VASN mRNA水平

用含潮霉素B的培养基培养1周，收集细胞，TRIzol提取细胞总RNA，取1 μg RNA，以Oligo dT为引物，用反转录酶将RNA反转成cDNA。20 μL体系中，以1 μL cDNA为模板，VASN-F/ VASN-R为引物进行RT-PCR实验，检测VASNmRNA表达水平。

1.7 细胞增殖实验

细胞生长曲线可以直观地反映细胞的增殖能力。胰酶消化对数生长期的VASN稳定敲除的细胞和野生型HepG2细胞，用新鲜培养基将细胞稀释至104/mL，按100 μL/孔种于96孔板。细胞贴壁时记为零点，分别在0、24、48、72、96 h时加入10 μL CCK-8试剂，细胞培养箱中孵育1.5 h，测定不同时间点的D450nm值，绘制细胞生长曲线。

1.8 Tranwell细胞迁移实验

将VASN稳定敲除的HepG2细胞和野生型HepG2细胞培养至对数生长期，胰酶消化，收集细胞，用新鲜培养基重悬细胞至2×105/mL；取200 μL细胞悬液种于Transwell小室的上层，小室下层加入500 μL新鲜培养基，细胞培养箱中培养12 h；用棉签擦去Transwell小室上层内侧细胞，用0.1%结晶紫染色，室温放置30 min；将多余的结晶紫冲洗干净，显微镜下观察细胞迁移情况并拍照；用30%的醋酸酒精洗脱穿膜的细胞，测定D450nm值。

1.9 统计学方法

用SAS软件分析数据，采用Student'st检验进行统计学分析，P＜0.05视为具有统计学差异。

2 结果

2.1 构建pCas-gRNA质粒

用Crispr Design程序设计gRNA，将靶位点序列设定在VASN编码基因起始位点后200～400 bp。为了降低脱靶的可能，共选取了3条gRNA序列。将合成的3对DNA片段分别退火形成双链，进而双酶切，然后与具有相同粘性末端的pCAS-guide载体连接，获得重组质粒pCAS-gRNA。重组子分别转化感受态细胞，LB平板培养，氨苄西林抗性筛选，挑取单克隆进行菌落PCR，鉴定为阳性的克隆测序（图1），结果表明3个pCAS-gRNA质粒均构建成功。

2.2 构建供体DNA质粒pBackZero-T-VASN

以HepG2细胞基因组为模板，分别以VASNLF/VASN-LR、VASN-RF/VASN-RR为引物，扩增VASN左、右同源臂片段VASN-L和VASN-R；以Hy-F/Hy-R为引物，质粒pSilencer2.1-U6hygro为模板，扩增潮霉素B抗性基因片段Hy（约1100 bp）（图2A）。将片段VASN-L、Hy和VASN-R混合作为模板，以VASN-LF和VASN-RR为引物扩增VASN同源臂供体DNA片段VASN-KO（图2B）。将单个碱基A添加在VASN-KO片段末端，进而与pBackZero-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，菌落PCR鉴定为阳性的克隆测序（图3）。序列比对结果显示，同源臂供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功。

图3 菌液PCR鉴定阳性克隆M：DNA marker DL2000；1～8：单克隆；NC：阴性对照；PC：阳性对照

2.3 基因组水平鉴定转染细胞株

将pCas-gRNA与pBackZero-T-VASN共转染HepG2细胞，基因组发生同源重组，潮霉素B抗性基因插入VASN基因的特定位点，使VASN不能正确表达。提取转染的细胞基因组DNA，以KO-F/ KO-R为引物进行PCR鉴定。结果显示2个重组质粒转染的细胞基因组DNA经PCR扩增后在750 bp处出现目的条带，而野生型HepG2细胞则无条带，证明潮霉素B抗性基因正确插入VASN基因的特定位点（图4），VASN读框已被破坏，VASN蛋白不能表达。

图4 基因组PCR鉴定M：DNA marker DL5000；NC：阴性对照；1、3、4：插入潮霉素B基因后片段

2.4 Western印迹鉴定VASN稳定敲除的单克隆细胞株

用无限稀释法筛选VASN敲除的细胞单克隆，培养约1周后显微镜下观察，将含有单克隆细胞的孔继续培养，并加入潮霉素进行抗性筛选。当细胞数量足够时，取出部分细胞提取总蛋白，Western免疫印迹鉴定，结果显示1～5号克隆的VASN蛋白表达水平均明显下调，1、4号最为显著（图5）。

2.5 RT-PCR鉴定VASN稳定敲除的单克隆细胞株

经过Western印迹鉴定，1号（1#）和4号（4#）VASN稳定敲除细胞中的VASN蛋白含量最低，因此将筛选出的1#、4#细胞做基因水平鉴定。收集细胞提取总RNA，反转录为cDNA，qPCR鉴定其VASNmRNA表达。1#细胞的VASNmRNA表达水平最低，只有野生型HepG2细胞（WT）的1/7（图6），统计学分析表明二者有明显差异，说明1#单克隆细胞中的VASN基因被基本敲除。

图5 Western印迹检测单克隆细胞株中VASN的表达

图6 RT-PCR鉴定VASN的mRAN水平WT为野生型HepG2细胞，1#、4#为VASN稳定敲除细胞

2.6 VASN稳定敲除的细胞株增殖能力下降

为了验证VASN蛋白对细胞增殖能力的影响，利用CCK-8法检测VASN敲除细胞和野生型细胞的增殖情况。将筛选出的1#VASN敲除细胞和野生型细胞培养至对数生长期，以1000/孔的浓度种于96孔板，贴壁后分别于0、24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8，37℃孵育1.5 h后测定D450nm值，得到细胞生长曲线（图7）。可以看出野生型HepG2细胞的生长速度明显高于VASN敲除细胞株，并且两者的差距随着时间的延长逐渐增大（P＜0.05）。此结果提示VASN蛋白可能参与细胞增殖过程。

图7 细胞生长曲线WT为野生型HepG2细胞，1#为VASN稳定敲除细胞

2.7 VASN稳定敲除的细胞株迁移能力下降

细胞迁移是反应细胞运动能力的重要指标，而且与侵袭和转移能力密切相关。我们利用Transwell实验检测了1#VASN敲除细胞和野生型HepG2细胞的迁移能力。结果显示，VASN敲除的细胞在膜上的覆盖面积明显小于野生型HepG2细胞（图8）。将穿过小室的细胞用30%醋酸洗脱，酶联仪测定D450nm值（图9），野生型HepG2细胞穿膜的细胞数约为VASN敲除细胞的2倍，VASN敲除细胞的迁移能力明显减弱（P＜0.05）。此结果提示VASN可能参与细胞的迁移过程。

图8 结晶紫染色观察细胞迁移（400×）A：野生型HepG2细胞；B：1#VASN稳定敲除细胞

图9 穿过Transwell小室的细胞吸光度A：野生型HepG2细胞；B：1#VASN稳定敲除细胞

3 讨论

自2004年Yuichi Ikeda等首次鉴定出VASN蛋白，迄今相关研究较少。已有报道显示，VASN蛋白可能与机体发育、血管损伤修复及肿瘤的发生发展相关。我们的前期工作表明，VASN不仅可能是一种新型的肝癌血清标志物，而且可能在肝癌的发生发展中具有重要作用[3]。

CRISPR/Cas9是新兴的基因编辑技术[6]，具有构建简单、剪切高效的特点[7]。向导RNA通过碱基互补配对，精确靶向目的基因序列，募集Cas9核酸内切酶到达目的基因，剪切基因组DNA。细胞通过2种修复机制，即同源重组修复和非同源末端连接修复，修复断裂的双链DNA[8-9]，本研究采用了精确度相对高的同源重组修复策略[10]，并且在提供同源重组所需的同源臂的同时，将潮霉素B抗性基因及终止子插入VASN基因起始位点下游，破坏VASN基因的开放读框，VASN蛋白不能正常表达，而抗性基因的表达为后续细胞筛选提供了便利。

在建立VASN稳定敲除HepG2细胞株后，我们开展了VASN蛋白生物学功能的初步探索和验证。利用CCK-8法和Transwell实验分别对比分析了VASN稳定敲除细胞株和野生型HepG2细胞间在增殖和迁移能力上的差异，结果显示缺失VASN蛋白可导致细胞增殖、迁移能力减弱，与已有研究结果相符，也进一步证明VASN缺失细胞株构建成功。这为深入阐释VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。

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