RP-HPLC法同时测定七味冬青叶散中苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素的含量

陈龙，张珂，刘雪滢，夏祥，黄健，王航宇，王金辉，**

（1 石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆 石河子，832002；2 兰州和盛堂制药股份有限公司，甘肃 兰州730000；3 哈尔滨医科大学药学院，黑龙江 哈尔滨150081）

七味冬青叶散由冬青叶、北沙参、甘草、天竺黄、丹参、杜鹃叶和苦杏仁七味药材组成，用于止咳、化痰、平喘、润肺；急慢性气管炎、支气管炎，肺纤维化，支气管扩张及肺炎，为内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室配制。方中丹参具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈等功效，丹酚酸B 为丹参主要指标性成分，且具有抗氧化、抗纤维化等作用[1-4]。苦杏仁具有润肺、止咳、滑肠等功效，苦杏仁苷为苦杏仁主要指标性成分，常作为祛痰止咳剂、辅助性抗癌药物[5，6]。杜鹃叶具有清热解毒，止血，化痰止咳等功效，杜鹃素为杜鹃叶主要指标性成分[7-8]。

目前，对于该制剂的测定方法尚未见报道，为了更有效的控制该制剂质量，本实验建立了同时测定七味冬青叶散中苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素的RP-HPLC 方法，可用于该制剂的质量控制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters 2695 型高效液相色谱仪，Waters 2998 型检测器，Empower 2.0 色谱工作站，DV215CD 型十万分之一电子分析天平（美国Ohaus 公司），KQ3200B型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司），XH-C型旋涡混合仪（金坛市医疗仪器厂），FW-100 型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司），TGL-16G 型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

七味冬青叶散（哲卫准字9604-105 号，生产批号：20150426，规格：15 g），苦杏仁、丹参、杜鹃叶均由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供，杜鹃素（批号：110850-201605，中国食品药品检定研究院），苦杏仁苷（批号：110820-201607，中国食品药品检定研究院），丹酚酸B（批号：111562-201716，中国食品药品检定研究院），甲醇（色谱级，J.K Baker 公司，美国），分析级磷酸（武汉化学试剂厂），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

1.2.1.1 检测波长的选择

参照中国药典2015 版一部正文苦杏仁、丹参、杜鹃项下，分别选择在210、286、297 nm 波长处测定含量。

1.2.1.2 流动相的选择

色谱柱：Sunfire C18 （150 mm ×4.6 mm，5 μm），流动相A：甲醇，流动相B：0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0 ～15 min：20% A →20% A、15 ～20 min：20% A →42% A、20 ～36 min：42% A →42%A、36～40 min：42% A→65% A、40～50 min：65%A→65% A，流速：1.0 mL·min-1，柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素各适量，分别置于5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解后，定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.018、0.9740 和0.9940 mg/mL 的苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素对照品储备溶液。

精密吸取1.018、0.9740 和0.9940 mg/mL 的苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素对照品储备溶液适量，置于5 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得每1mL 含苦杏仁苷407.2 μg、丹酚酸B 389.6 μg、杜鹃素19.80 μg 的混合溶液A。

精密吸取1.018、0.9740 和0.9940 mg/mL 的苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素对照品储备溶液适量，置于100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解后，定容至刻度，摇匀即得每1mL 含苦杏仁苷217.0 μg、丹酚酸B 158.5 μg、杜鹃素5.900 μg 的混合溶液B。

1.2.3 阴性样本溶液的制备

取冬青叶、北沙参、甘草和天竺黄各药材适量，粉碎成细粉，过60 目筛，取过筛后细粉按照处方中一定比例配制样品，混合均匀后置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，摇匀，称取重量，室温下超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000 r/min，10 min），离心后吸取上清液用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，即得阴性样本溶液。

1.2.4 供试品溶液的制备

1.2.4.1 七味冬青叶散溶液的制备

取七味冬青叶散粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，摇匀，称定重量，室温下超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000 r/min，10 min），离心后吸取上清液用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取滤液作为七味冬青叶散供试品溶液，每次吸取10 μL注入高效液相色谱仪中分析。

1.2.4.2 苦杏仁、丹参、杜鹃叶供试品溶液的制备

取各药材适量，粉碎，过60 目筛，精密称定苦杏仁粉末约0.1 g、丹参及杜鹃叶粉末约0.25 g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，摇匀，称定重量，室温下超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000 r/min，10 min），离心后吸取上清液用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，即得苦杏仁、丹参及杜鹃叶供试品溶液，吸取各供试品溶液10 μL 注入高效液相色谱仪中分析。

2 结果与分析

2.1 专属性考察

精密吸取甲醇溶剂、阴性样本溶液、混合溶液A和七味冬青叶散供试品溶液在“2.1”色谱条件下进样分析，进样量10 μL，苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，对称因子均在0.95～1.05 之间，理论板数按丹酚酸B 峰计算大于5000，在对照品色谱峰位置处，供试品具有相同保留时间的色谱峰，空白溶剂甲醇在此保留时间处无色谱峰，各药材在相同波长下具有同一保留时间的色谱峰（图1）。

图1 空白溶剂、对照品、供试品和阴性溶液的HPLC 图Fig.1 HPLC chromatograms of blank solvent，reference substance，sample and negative solution

2.2 线性关系考察

取混合溶液A，分别精密吸取1、2、6、10、14、18、22 μL 在“2.1”色谱条件下注入高效液相色谱仪分析，以混合对照品溶液中各对照品的浓度（C）为横坐标，峰面积A 为纵坐标，计算回归方程，结果显示苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素在一定范围内呈良好线性关系，所得回归方程及线性范围见表1。

表1 苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素的线性回归方程n=7Tab.1 Regression equation of nitrilosides，salvianolic acid B and farrerol

2.3 精密度试验

取同一混合溶液A 重复进样6 次，进样量10 μL。计算苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素峰面积的RSD 值分别为：0.70%、0.55%和0.45%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

取室温下放置的同一份七味冬青叶散供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、18、20 h 进样分析，进样量10 μL，测得苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素的峰面积的RSD 值分别为1.3%、0.94%和0.86%，表明七味冬青叶散供试品在室温下放置20 h 稳定。

2.5 重复性试验

取同一批号七味冬青叶散供试品6 份，按“2.4.1”供试品制备方法制得供试品溶液，在“2.1”色谱条件下进样分析，进样量10 μL，测得苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素的含量分别为0.43%、0.32%、0.012%，RSD 值分别为1.5%、1.9%和1.5%，表明该方法重复性良好。

2.6 加样回收率试验

取已测含量的同一批次七味冬青叶散供试品6 份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入与样品中各成分等量的混合对照品溶液B 10 mL，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下进样分析，进样量10 μL，测得苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素平均回收率结果见表2。

表2 苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素的回收率测定结果 n=6Tab.2 Recovery of nitrilosides，salvianolic acid B and farrerol

2.7 样品测定

取七味冬青叶散按“2.4.1”方法制备供试品溶液，苦杏仁、丹参、杜鹃叶按“2.4.2”方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下进样分析，每次进样10 μL，测定各样品苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素的含量，结果见表3。

以七味冬青叶散中苦杏仁苷为例，称取七味冬青叶散粉末1.00297 g，加入色谱甲醇10 mL，超声离心处理后，进入液相分析，进样量为10 μL，计算结果为：

供试品溶液的浓度=1.00297g/10mL=0.100297 g/mL=100.297 mg/ml=100.297 μg/μL。100.297 μg/μL×0.436%=0.4372949 μg/μL。

进样量G=0.4372949 μg/μL×10 μL=4.372949 μg。苦杏仁苷进样量G 的范围为：0.4072-8.958 μg，符合范围。

同理，单味药材以杜鹃叶中杜鹃素为例，称取杜鹃叶粉末0.25240 g，加入25 mL 色谱甲醇，超离心处理后，进入液相分析，进样量为10 μL，计算结果为：

杜鹃叶供试品溶液的浓度=0.25240 g/25 mL=0.010096 g/mL=10.096 mg/mL=10.096 μg/μL。0.096 μg/μL ×0.088%=0.00888448 μg/μL。进样量G=0.00888448 μg/μL×10 μL=0.0888448 μg。杜鹃素 进样量G 的范围为0.01988-0.4374 μg，符合范围。

表3 样品含量测定结果 n=3Tab.3 Results of the contents determination of samples

3 讨论

（1） 参照2015 版《中华人民共和国药典》，苦杏仁苷的最大吸收波长为210 nm，丹酚酸B 的特征吸收波长为286 nm，杜鹃素的最大吸收波长为297 nm，在本实验中，选用了210、286、297 nm 为检测波长，能兼顾各个组分的检测，且各组分响应值均匀，具有良好的代表性。

（2） 为了使苦杏仁苷、丹酚酸B 和杜鹃素更好的分离，且不受其他组分和溶剂的干扰，在方法建立的过程中，对流动相的组成进行了优化，采用乙腈-0.1%的磷酸溶液、甲醇-0.1%的磷酸溶液和甲醇- 水为流动相，梯度洗脱。结果显示，以甲醇为有机相的流动相系统，分离效果好，加入磷酸使峰型得到了优化，故选择甲醇-0.1%的磷酸溶液作为流动相。

（3）考察了提取溶剂用量对提取率的影响，分别选择了10 mL、25 mL 的甲醇对供试品进行超声提取30 min，结果显示，溶剂用量为10 mL 时，既可以将上述3 种成分完全提取，同时也满足实验中3 种成分的用量，因此，本实验选择10 mL 甲醇提取溶剂，超声时间30 min 作为供试品的处理方法。

本方法快速简单，结果准确，重现性好，稳定性高，应用于七味冬青叶散的含量测定，完善其质量控制。