不同光质对葛仙米的生理影响

刘树文， 牟丹敏

(贵州师范学院化学与生命科学学院，贵州贵阳 550018)

拟球状念珠藻(NostocsphaeroidesKützing)别称葛仙米，是一种生长在我国极少数山区水稻田中的念珠藻，属多细胞蓝藻，具有较高的食用价值和食疗保健的药用价值[1-2]。葛仙米因晋朝的道教伦理学家、医学家、炼丹家葛洪的名字及其经历而命名，是中国出口的一种传统珍贵野生食品，在《本草纲目》《本草纲目拾遗》中对其均有记载[1-3]。近年来由于农民施用化肥及除草剂等农药，改变了葛仙米赖以生存的生长环境，导致葛仙米产量急剧降低，甚至有绝迹的可能[4]，这些都将影响这一珍贵野生食品的开发和利用。为了让更多的人品尝到这种珍稀藻类，首先应该采取适当的措施保护好葛仙米的野生资源，使其脱离濒临灭绝的危险；同时进行开发研究，最终走广泛和深层次的产业化培养葛仙米的道路[1-2]。近年来，一些科研工作者开展了关于葛仙米的人工养殖研究。

光照是影响藻类光合作用效率的重要环境条件，在藻类人工培养过程中通常需要合理的光照度和光照周期。然而，许多研究表明，不同颜色的光(光质)对藻类的生长及生理也会产生较大的影响。Aidar等发现微小环藻(Cyclotellacaspia)在蓝光下生长速率最高，而亚心形扁藻(Tetraselmisgracilis)在红光下生长较快[5]；Wang等发现红光能够提高钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)的比生长速率，而该藻在蓝光下光量子转换成生物量的效率最低[6]；Das等研究发现，蓝光能够提高微拟球藻(Nannochloropsissp.)的比生长速率，而红光下微拟球藻的比生长速率最低[7]；毛安君采用单色LED光源和荧光灯从效率和速率2个角度研究了光源光谱对海生小球藻(Chlorellavulgari)和等鞭金藻(Isochrysis)生长的影响，发现连续光谱能够促进最大生长率提高，蓝光促进生长的效率较高，两者组合能够较好地兼顾效率和速率[8]。因此，光质对人工培养的不同藻类会产生不同的生理影响。

蓝藻含有叶绿素a(chlorophyll-a，简称Chla)、类胡萝卜素(carotenoids，简称Car)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称PC)、藻红蛋白(phycoerythrin，简称PE)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)等多种光合色素。叶绿素主要吸收640～660 nm的红光和430～450 nm的蓝紫光，类胡萝卜素主要吸收400～500 nm波长的光，PE、PC、APC的最大吸收波长分别为540～570、610～620、650～655 nm[9]。关于光质对蓝藻葛仙米生理影响的相关研究较少。本研究通过测定3种不同的光质(白光、红光、蓝光)下葛仙米的比生长速率及各种光合色素、可溶性糖和可溶性蛋白含量，探讨3种不同的光质对葛仙米的生理影响，寻找适合葛仙米人工养殖的光质，为葛仙米的规模化养殖提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　材料与培养条件

葛仙米采自贵州省岑巩县凯本乡沈家湾村的水稻田中。葛仙米的培养采用BG110培养基，在121 ℃、1.05 kg/cm2条件下灭菌30 min。藻种经过匀浆之后，分别接种到9个高压灭菌的500 mL锥形瓶中，加入450 mL BG-110培养基，初始接种量为450 μg/mL叶绿素。培养温度26 ℃，用白光、红光、蓝光3种不同颜色的LED灯提供不同颜色的光照，3种颜色光的光照度控制在820 lx左右，每种颜色的光照条件设置3个重复。用空气泵通入用0.22 μm滤膜过滤的无菌空气，通气量为300 mL/min。

1.2　生长曲线的制作和比生长速率的测定

在葛仙米的生长的0、2、4、6、8、10 d，于每天12：00在每瓶培养液中分别取1次藻液，藻液体积为10 mL。离心 30 min，倒掉上清液，加入3 mL 95%乙醇，振荡，放入4 ℃冰箱中过夜。4 000 r/min离心30 min后，取上清液，用分光光度计测定D665 nm和D649 nm。叶绿素a含量按如下公式计算[10]：Chla含量(mg/L)=13.95D665 nm-6.88D649 nm。比生长速率的计算根据公式：μ=(lnX1-lnX2)/(T10-T0)。式中：X1、X2分别是0、10 d的叶绿素a含量，μg/L；T10、T0分别表示10、0 d。采用Origin 7.0软件绘制时间(天)、叶绿素含量(μg/L)的生长曲线图。

1.3　各种主要光合色素含量的测定

各瓶葛仙米培养的10 d，在培养光照颜色分别为白光、红光、蓝光的培养瓶中各取20 mL藻液，按照“1.2”节的方法取样和提取色素，用分光光度计测定665、649、447 nm波长的吸光度D665 nm、D649 nm、D470 nm。计算叶绿素a含量。因为葛仙米为蓝藻，不含叶绿素b，因此类胡萝卜素含量计算依据以下公式[10]：Car含量=1 000×D470 nm-2.05×Chla含量。

在10 d时，另在培养光质分别为白光、红光、蓝光的培养瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min离心30 min，去上清夜，各加入4 mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸缓冲液，冰浴匀浆90次，4 000 r/min离心30 min。取上清液，用分光光度计测定上清液在562、615、652 nm波长的吸光度D562 nm、D615 nm和D652 nm。藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白的含量根据Siegelman & Kycia的公式计算[11]：PC含量(mg/mL)=(D615 nm-0.474D652 nm)/5.34；APC含量(mg/mL)=(D652 nm-0.208D615 nm)/5.09；PE含量(mg/mL)=(D562 nm-2.41PC含量-0.849APC含量)/9.62。

1.4　蛋白质含量的测定

各瓶葛仙米培养10 d，按照“1.3”节提取3种藻胆蛋白的方法提取白光、红光、蓝光的培养瓶中葛仙米的可溶性蛋白，取上清液，用考马斯亮蓝法测定各样品中蛋白质的浓度[10]。

1.5　可溶性糖含量的测定

培养10 d的葛仙米藻液各取20 mL，4 000 r/min离心 30 min，去上清液，各加入4 mL 蒸馏水，冰浴匀浆90次，4 000 r/min 离心30 min，提取得到葛仙米的可溶性糖。取上清液，用蒽酮试剂法测定各样品中可溶性糖浓度[10]。

1.6　统计分析

本研究主要采用软件Origin 7.0、STATISTICA®7.0(StatSoft Inc，Tulsa，OK，USA)进行统计分析处理，采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey显著性检验(HSD)检测不同处理间的显著性水平。

2　结果与分析

2.1　不同光质条件下葛仙米的生长

图1表明，葛仙米分别在白光、红光和蓝光下培养10 d后，以叶绿素a浓度表示的生物量分别增加到第1天的3.83倍、4.98倍及1.91倍。由表1可知，红光培养葛仙米的比生长速率最大，蓝光培养葛仙米的比生长速率最小，与白光培养葛仙米的比生长速率相比，红光培养的增加了23.08%，但两者之间差异不显著(Tukey’s HSD)；蓝光培养的降低了53.85%，且差异显著(Tukey`s HSD，P<0.05)。

2.2　不同光质条件下葛仙米的光合色素含量和比例的变化

由表2、表3可知，红光培养的葛仙米PC、Chla、Car含量略高于白光培养的葛仙米，APC、PE含量略低于白光培养的葛仙米，但都没有显著差异。蓝光培养的葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car含量都显著低于白光和红光培养的葛仙米(P<0.05)。红光培养的葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car含量分别为蓝光培养葛仙米的175%、165%、126%、240%、158%(P<0.05)。

表1　不同光质条件下葛仙米的比生长速率

注：同列数据后不同小写字母表示不同处理间在0.05水平差异显著。下表同。

表2　不同光质条件下葛仙米的PC、APC、PE含量

表3　不同光质条件下葛仙米的叶绿素a和类胡萝卜素的含量

由表4可知，蓝光和白光培养条件下，葛仙米的PC、APC、PE、Car含量与Chla含量的比值分别为红光培养葛仙米的137%、182%、193%、153%和107%、148%、146%、106%。

表4　不同光质条件下葛仙米的PC、APC、PE、Car含量

2.3　不同光质条件下葛仙米可溶性蛋白含量的变化

由图2可知，溶液中可溶性蛋白含量(y)与考马斯亮蓝染色后的可溶性蛋白溶液在595 nm波长下的吸光度(x)之间的直线方程为y=1.298 4x+0.007 2(r2=0.99)。由图3可知，蓝光培养葛仙米的可溶性蛋白含量最高，分别为红光、白光培养葛仙米的189%、161%(P<0.05)。红光培养葛仙米的可溶性蛋白含量略低于白光培养葛仙米，但无显著差异。

2.4　不同光质条件下葛仙米可溶性糖含量的变化

由图4可知，溶液中可溶性糖含量(y)与蒽酮试剂染色后的可溶性糖溶液在620 nm波长下的吸光度(x)的直线方程为y=1.569 1x+0.094 1(r2=0.188 2)。由图5可知，红光培养葛仙米的可溶性糖含量最高，分别为白光、蓝光培养葛仙米的122%、176%(P<0.05)。红光培养葛仙米的可溶性糖含量略高于白光培养葛仙米。

3　讨论与结论

不同的光质培养条件对葛仙米的生长产生不同的影响。红光培养条件下葛仙米的以叶绿素含量表示的总生物量及比生长速率最大，白光次之，蓝光最小，这表明红光对葛仙米的生长最有利。Wang等的研究结果也表明，红光培养条件下螺旋藻的生长最快[6]，与本研究的结论一致。然而，Das等研究发现，蓝光能够提高微拟球藻(Nannochloropsissp.)的比生长速率，而红光下微拟球藻的比生长速率最低[7]。不同的藻类具有不同的光合色素组成，光合作用过程对光照颜色的要求也不同，如钝顶螺旋藻生长需要较低的光照度，而蓝光因为波长较短、能量较高而不利于其生长，相反红光却能促进钝顶螺旋藻的生长[12]。

蓝藻的眉藻(Calothrix)和点形念珠藻(Nostocpunctiforme)能通过改变藻细胞内各种光合色素的含量和比例来适应不同的光质条件，即“补色适应”现象[12-14]。本研究的结论也表明，葛仙米在不同的光质培养条件下，各种光合色素的含量及比例发生变化，以此来适应不同的光质条件。葛仙米叶绿素a、类胡萝卜素、藻蓝蛋白的含量大小顺序为红光>白光>蓝光。别藻蓝蛋白、藻红蛋白含量大小顺序为白光>红光>蓝光。然而，蓝光虽然抑制了培养液中葛仙米的各种光合色素含量的增加，但在蓝光培养条件下葛仙米的各种藻胆蛋白及类胡萝卜素与叶绿素含量的比值却升高。类胡萝卜素、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白与叶绿素含量的比值大小顺序为蓝光>白光>红光。有研究表明，红光促进蓝藻藻蓝蛋白和叶绿素的合成，抑制藻红蛋白的合成[15]。

葛仙米可溶性蛋白含量大小顺序为蓝光>白光>红光，而葛仙米可溶性糖含量大小顺序为红光>白光>蓝光。在红光下生长的葛仙米光合效率高，能产生更多的光合产物，有利于碳水化合物的积累[15-16]。但蓝光波长短、能量高，容易对藻类产生光抑制伤害，不利于光合碳固定以及糖类的合成，但有利于可溶性蛋白含量的积累[15-16]。王伟发现蓝光能够促进中华盒形藻蛋白质的合成，而红光下碳水化合物含量增加[16]，这与本研究的结论一致。

综上，红光有利于葛仙米的快速生长，不同的光质影响葛仙米的色素含量和比例。红光促进葛仙米可溶性糖的积累，而蓝光有利于可溶性蛋白的合成。葛仙米含有丰富的各种光合色素，具有较为广阔的开发应用前景，可作为天然色素在食品、化妆品、染料等工业领域应用，并可制成荧光试剂用于医学临床诊断和免疫学及生物工程等研究领域，还可制成食品和药品用于医疗保健[17]。葛仙米含有18种氨基酸，含有人体必需的8种氨基酸，其多糖具有较好的保健作用[17]。在葛仙米的人工养殖过程中应该根据实际需要选择不同颜色的光照。

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