CTGF对犬眼小梁切除术后滤过泡瘢痕化和眼压的影响

张东彦 ， 郑之琬 ， 栾司琦 ， 郑小波

(西南大学动物科学学院 ， 重庆 荣昌 402460)

小梁切除术能够有效降低眼压，是人医上各类型青光眼最常用的手术方式。而该术式已有学者移植到犬的青光眼治疗当中。但滤过通道瘢痕化常导致眼压再次升高，使得手术失败。因此，如何抑制、减少滤过泡瘢痕化和保证滤过通道的通畅是手术成功的关键。

CTGF是一类致纤维化生长因子，广泛存在于多种动物组织器官中，多种细胞可表达CTGF[1]。但在病理状态下，CTGF的过表达与某些纤维化性和增生性疾病的发生、发展密切相关，并且在机体组织的损伤修复过程中起决定性作用。目前，CTGF在人医的眼科研究中尚处于起步阶段，有关其在滤过泡组织瘢痕化过程中的表达及作用，在国内外鲜有报道，动物眼科研究上更是空白。因此本试验通过对犬结膜瘢痕化模型的建立，以免疫组织化学方法从蛋白水平观察CTGF在结膜下滤过泡组织中的表达，以及通过外源性CTGF注入滤过泡中观察其对滤过泡瘢痕形成和眼压的作用，初步探讨CTGF对滤过泡组织瘢痕化和眼压的影响，为提高犬青光眼小梁切除术的成功率提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验动物杂交犬32只，3月龄，公母各半。购自重庆市荣昌区肉犬养殖基地。

CTGF液的配置：购入重组CTGF 20 μg，-20 ℃保存。取0.41 g NaAc溶解到1 L蒸馏水中，取0.2 mL NaAc溶液溶解20 μg CTGF，加入1 mL PBS形成1.2 mL CTGF液。

1.2 试验方法

1.2.1 手术方法及免疫组织化学染色切片 手术参照史亚利手术方法[2]。于术前及术后第3、5、7、14、21、28 天取出眼球置于4%甲醛中4 ℃固定24 h，剪取滤过泡区域的结膜、结膜下组织及巩膜的块状组织(5×5 mm),流水冲洗8 h，经梯度酒精脱水后，行浸蜡、包埋、切片。试验组与对照组各时间点随机选取3张供CTGF免疫组织化学染色观察和分析。

1.2.2 免疫组化染色观察结果的判断 定性观察：CTFG蛋白免疫组织化学染色结果的判定标准[8]：光镜下观察，细胞浆呈黄色或深棕色为CTGF染色阳性。以PBS代替第一抗体作为阴性对照。CTGF相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外胞核和胞浆内无棕黄色反应物。

定量分析：采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对CTGF的表达进行定量分析。每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率(阳性反应总面积所占分析视野面积的百分比)，用以表示阳性物质的相对含量。

1.2.3 外源性CTGF注入 将已经进行小梁切除术的犬16只随机分为试验组和对照组，试验组犬术眼结膜瓣下分别注入0.2 mL CTGF液，对照组犬术眼结膜瓣下分别注入0.2 mL生理盐水。术后每天对术眼涂抹地塞米松软膏3次，连续使用1周。

1.2.4 术后滤过泡的观察 小梁切除术后每天分别对每只术犬术眼用裂隙灯严格进行观察，参照Khaw方法观察滤过泡颜色和隆起度、形态，将滤过泡充血微隆起或消失，结膜下瘢痕化粘连在巩膜表面，局限原顶状隆起多血管外观，呈囊样增生为致密的球结膜空腔定义为滤过泡失败，记录滤过泡失败时间，以此评价术后滤过泡的生存情况。

1.2.5 眼压的测定 术前以及术后1、3、5、7、14、21 d对术眼进行眼压的测定并记录。

2 统计分析

3 试验结果

3.1 免疫组织化学染色观察 对照组免疫组化染色情况：染色阳性信号为棕黄色颗粒。染色各时间点只见少量棕黄色颗粒，着色淡，CTGF染色几乎无阳性信号(见中插彩版图1)。

阴性对照组免疫组化染色情况：阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物(见中插彩版图2)。

3.2 试验组免疫组化染色情况 术后第3天：CTGF染色可见颗粒状和弥散性分布的棕黄色颗粒，开始出现阳性信号，主要分布于结膜上皮细胞、巩膜、脉络膜结缔组织中的成纤维细胞胞浆中(见中插彩版图3)。

术后第5天：CTGF染色可见棕黄色颗粒比上组增多，阳性信号较上组增强(见中插彩版图4)。

术后第7天：CTGF染色可见棕黄色颗粒在整个试验组达到最多。阳性信号增强达高峰，染色密度无明显差别(见中插彩版图5)。

术后第14天：CTGF染色可见棕黄色颗粒开始渐减，阳性信号开始减弱(见中插彩版图6)。

术后第21天：CTGF染色可见棕黄色颗粒较14 d 减少，阳性信号持续减弱(见中插彩版图7)。

术后第28天：CTGF染色阳性棕黄色颗粒大量减少，阳性信号明显减弱，阳性信号略强于空白对照组。染色可见极少量棕黄色颗粒(见中插彩版图8)。

3.3 CTGF蛋白定量分析结果 试验组中CTGF蛋白阳性颗粒面的阳性面积率随手术后时间变化呈先升高后下降的变化，在第7天达到峰值(图9)。对照组中CTGF蛋白阳性颗粒几乎观察不到。手术后第7天试验组与对照组差别具有极显著性意义(P<0.01)，手术后第3、7天，差别具有显著性意义(P<0.05)。对照组各时间点密度值的差别无统计学意义(P>0.05)。

图9 手术前后CTGF蛋白质颗粒的阳性

3.4OD值分析结果 试验组中OD值随手术后时间变化呈先升高后下降的变化，在第7 天达峰值(图10)。对照组中OD值变化不大(图10)。手术后第7天试验组与对照组OD值差别具有极显著性意义(P<0.01)，手术后第3、 7天，差别具有显著性意义(P<0.05)。对照组各时间点密度值的差别无统计学意义(P>0.05)。

图10 手术前后OD值比较

3.5 术后眼压的变化 术前和术后第1、3、5、7、14、21天眼压的测定结果(表1)，术后试验组和对照组各时间点的眼压测定值差异都具有统计学意义差异极显著(P<0.01)。

3.6 术后滤过泡的变化 试验组和对照组犬小梁切除术术后滤过泡失败时间如表2所示。试验组平均滤过泡失败时间为13.16±0.98 d，对照组平均滤过泡失败时间为20.05±1.05 d。差别有统计学意义(P<0.01)。

表1 术前及术后各时间点眼压测定值

表2 术犬滤过泡失败时间

4 分析讨论

CTGF最早是Bradham等[3]用亲和色谱法在人脐静脉内皮细胞条件培养基中发现的，广泛存在于多种人类组织器官中，如心、脑、肺、肾、胎盘、胰腺和结缔组织。多种细胞都可表达CTGF。正常情况下体内的CTGF表达很低或者无，但在病理状态下CTGF可过度表达并与某些增生性或纤维化性疾病的发生、发展密切相关。CTGF的生物学作用及作用机制尚未明确，目前认为CTGF有调控细胞分裂、粘附和迁移、诱导ECM产生等功能，从而在调控细胞增殖、分化、胚胎发育、血管生成、伤口愈合、肿瘤生长、炎症、纤维化疾病等方面有重要作用[4-5]。试验切片染色观察中，CTGF主要在滤过泡组织成纤维细胞中异常表达，而周围的正常组织中，CTGF的表达相对较少。Tang等[6]的研究发现，兔抗青光眼滤过手术术后结膜滤过泡组织中存在CTGF的高表达，并且在术后第5天达最高值与我们的试验结果基本一致。而Igarashi等[7]通过原位杂交的方法发现，增生性瘢痕组织中成纤维细胞存在CTGF mRNA强阳性表达信号，从基因水平证实了组织纤维化进程中CTGF表达的增高。由此可以推测，在滤过泡瘢痕化过程中，CTGF先进行转录，进而翻译成CTGF蛋白质，CTGF蛋白质可能刺激组织中成纤维细胞的增殖和以胶原为主的细胞外基质的沉积，增殖的成纤维细胞又会产生更多的CTGF，反复循环，最终形成大量的纤维化瘫痕组织。CTGF仅是在滤过泡区中局部异常表达，而在周围正常组织中没有表达高峰，可以提示我们，抑制滤过泡瘢痕化，局部治疗可能是必要而有效的。

本试验CTGF蛋白定量分析试验组中CTGF蛋白阳性颗粒的密度值和OD值随术后时间变化都呈先升高后降低的变化。手术后第7天试验组各值与对照组相比极显著下降，手术后第5、7天各值的差别具有显著性意义，对照组中密度值组间变化无统计学意义。表明CTGF与犬眼青光眼滤过术后滤过泡组织中瘢痕形成有关，这与唐卫华等[8]的试验结果基本一致。我们的试验研究证实了CTGF在青光眼滤过手术后滤过泡瘢痕形成过程中起到重要作用，假如能应用一些阻断CTGF表达或抑制其生物活性的物质，选择性地作用于CTGF靶位，可能更特异、更有效地抑制成纤维细胞增殖，防止青光眼滤过手术的失败。

为了进一步探究CTGF在滤过泡瘢痕形成过程中的作用，术眼结膜瓣下分别注射0.2 mL CTGF液和0.2 mL生理盐水。观察滤过泡的情况和眼压变化。试验组滤过泡失败时间为13.16±0.98 d，与对照组滤过泡失败时间20.05±1.05 d比较，差别有统计学意义。证实了外源性CTGF的注入极显著的提前了小梁切除术术后滤过泡的失败时间，与唐卫华、汪昌运、柯美魁等人的相关研究一致[8]。进行小梁切除术后试验组以及对照组术眼眼压有明显的降低，证明了小梁切除术能够有效降低眼压[9]。但术后第1、3、5、7、14、21天试验组眼压比对照组眼压上升明显，则表明了CTGF的注入加速滤过泡瘢痕的形成，导致滤过道阻塞从而使犬小梁切除术后眼压升高。

综上所述，在犬眼施行小梁切除术可以达到降低眼压的效果。CTGF表达水平在手术后呈先升高后下降的变化，7 d达峰值。当外源性注入CTGF，加速了滤过泡瘢痕形成并导致眼压升高。

参考文献：

[1] Saika S, Yamanaka O, Baba Y,etal. Accummulation of latent transforming growth factor-beta binding protein-1 and TGF beta 1 in extracellular matrix of filtering belb and of cultured human subconjunctival fibroblasts [J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2001,239(3):234-241.

[2] 史亚利，郭音，许洁, 等. 犬眼小梁切除术后滤过泡形态与眼压的关系[J]. 中国兽医杂志，2014，50(12)：56-58.

[3] Bradham D M, Igarashi A, Potter R L,etal. Connective tissue growth factor: a cysteine-rich mitogen secreted by human vascular endothelial cells is related to the SRC-induced immediate early gene product CEF-10[J]. J Cell Biol,1991,114(6):1 285-1 294.

[4] Jampel H D, Roche N, Stark W J,etal. Transforming growth factor-beta in human aqueous humor[J]. Curr Eye Res,1990,9:963-969.

[5] Duncan M R, Frazier K S, Abramson S,etal. Connective tissue growth factor mediates transforming growth factor-beta induced collagen synthesis: down-regulation by cAMP[J]. Faseb J,1999,13(13):1 774-1 786.

[6] Tang W H, Wang C Y, Ke M K,etal. Expression of connective tissue growth factor after trabeculectomy in rabbit ocularmodel[J]. Int J Ophthalmol,2008,8(5):896-898.

[7] Igarashi A, Nashiro K, Kikuchi K,etal. Connective tissue growth factor gene expression in tissue sections from localized scleroderma, keloid, and other fibrotic skin disorders[J]. J Invest Dermatol,1996,106(4):729-733.

[8] 唐卫华，汪昌运，柯美魁，等. 外源性结缔组织生长因子在兔眼小梁切除术后滤过泡瘢痕形成中的作用[J].临床眼科杂志，2009，8(2)：178-180.

[9] 姚琳，王大博，白海青，等. 结缔组织生长因子在兔眼结膜下组织创伤愈合过程中的表达[J].眼科研究，2008，26(11)：837-840.