人脑型肌酸激酶SNP突变体二体解离与活性关系的研究

董桂香，王爱国，王雷鸣

(郑州市骨科医院，河南 郑州 450052)

肌酸激酶是人体生物体内能量代谢的关键酶，在生物体内一些关键耗能的细胞和组织中均存在分布，肌酸激酶的四种同工酶主要以二聚体形式存在，且脑型肌酸激酶在许多疾病诊断中得到广泛使用[1，2]。人体基因组中由于单个核苷酸发生变化，导致DNA序列产生多样性，临床将其称为单核苷酸多态性（SNP）[3，4]。 SNP 在人体中含量相对较高，并且分布较广，具有一定的遗传性，并且其表达水平与人脑肌酸激酶活性有关，能在一定程度上影响人脑型肌酸激酶结构、功能等，诱导期能力代谢异常[5，6]。本研究旨在探讨人脑型肌酸激酶SNP突变体二体解离与活性的关系，现将研究结果简要报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年12月-2016年12月医院采集有人脑部组织的患者50例，男28例，女22 例，年龄 38～62 岁，平均（45.64±4.53）岁。疾病类型：24例脑梗死，16例脑出血，10例颅脑外伤。入选患者均符合1996年全国第四届脑血管病学术会议中关于脑血管疾病临床诊断标准[7]，均经过生化指标、头颅CT检查或MRI得到确诊。不同患者性别、年龄、疾病类型比较差异无统计学意义。

1.2 方法 ⑴测定原理。采用pH-比色法测定标本组织中肌酸激酶的活性，并对肌酸激酶的底物进行反应动力学试验。肌酸激酶在催化正向反应时会随着ATP向肌酸上转移磷酰基的同时产生相同摩尔的氢离子，其最适宜的pH为7.5～9.0，属于一个宽阔的平台状。在该范围内测定氢离子的生成速度可以作为酶活力的测定指标。⑵脑型肌酸激酶SNP突变体的裂解与分离：取获得的人脑部组织，加入5mmol/L乙醇，保证溶液PH值为7.5，加入50mmol/L Tris-HCL液支撑匀浆，15min离心，速度为31000r/min，去除沉淀，获得上层清液I；在磁力搅拌下缓慢加入预冷的浓度为95.0%乙醇，保证溶液溶度为50.0%，继续搅拌30min，15min离心，获得上层清液Ⅱ。再加入乙醇提高药物浓度为70.0%，15min离心，速度为3400r/min，去除上层清液Ⅲ，将获得的沉淀中加入Tris搅拌后均匀，15min离心，速度为31000r/min，获得上层清液Ⅳ，Tris透析1h后行Q-Sephsrose HP柱层析，控制流速为0.7ml/min。样品上柱后，利用Tris洗涤，然后再用含0-500mmol/L NaCl的Tris液进行梯度洗脱，分别合并CK-BB和NSE峰值管，放置在Tris液中进行24h透析，-80℃下贮存，完成脑型肌酸激酶SNP突变体的裂解与分离。由SDS-PAGE与native-PAGE检测均为一条带。⑶检测方法。采用280nm光吸收完成酶浓度的监测，人脑部组织消光系数为8.8。根据文献[8]方法进行，测定体系中含有底物肌酸与ATP及镁离子，利用百里酚蓝作为pH指示剂，利用pH比色法测定酶的活性[9，10]。结缔组织与神经组织后加入150ml浓度为0.01mol/L的KCl，利用组织打碎机、高速分散器进行3次粉碎，每次不超过30s，冰浴下离心15min，速度为8000r/min，取沉淀进行干燥，最终获得人脑型肌酸激酶样品。取样作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，测量其亚基分子量，检测其是否达到电泳一条带的纯度，再次取样采用凝胶层析法测量该酶的分子量[11，12]。

1.3 统计分析 采用SPSS 18.0软件处理，计数资料行x检验，采用n（%）表示，计量资料行t检验，采用（x±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人脑型肌酸激酶SNP突变体二体解离活性分析 人脑型肌酸激酶SNP突变体二体解离体对于酶的抑制反应是不可逆的反应。从图1中可以看出产物浓度的对数与时间的变化为线性关系。通过曲线的斜率与抑制剂的浓度结果显示：A值与SNP突变体二体解离存在正相关关系，见图1。

图1 人脑型肌酸激酶SNP突变体二体解离活性分析（图中1、2、3、4、5表示连续测定的5个数据点）。

2.2 不同氨基酸位点对人脑型肌酸激酶活性的影响 本课题研究了26、36、59级267位氨基酸发生突变的人脑型肌酸激酶SNP突变体活性与二体稳定性的关系，结果显示：H26Y、P36T和T59I氨基酸更加容易发生解离，二体的解离与酶功能丧失成正相关性。由于空间排阻效应影响二体形成蛋白质的折叠途径，导致SNP突变及动力学差异显著（P<0.05），见表 1。

表1 不同氨基酸位点对人脑型肌酸激酶活性的影响

3 讨论

肌酸激酶在人体脑部组织中含量丰富，不仅存在于星形细胞中，也存在于神经元中，如神经元轴突、树突、子宫及甲状腺中，但是这些组织中的肌酸激酶远远低于人脑组织中[13]。因此，临床上将肌酸激酶用于临床疾病诊断中效果理想，且诊断具有特异性[14]。通常来说，人脑型肌酸激酶水平的升高提示脑部损伤，且从功能可以分为四种：肌肉型、脑型、杂化型和线粒体型。有报道显示[15]，细胞内约有1%的氧被用于氧化细胞内的蛋白质，并且在衰老动物细胞中氧化的蛋白质能占总蛋白质的30.0%～50.0%，并且氧化过程中伴有蛋白质的交联、多肽链的断裂、不同氨基酸的转化以及氨基酸残基的修饰。由此看出：人脑型肌酸激酶在人体中蛋白的合成、分解中发挥了重要的作用。本研究中，人脑型肌酸激酶SNP突变体二体解离体对于酶的抑制反应是不可逆的反应。从图1中可以看出，产物浓度的对数与时间的变化为线性关系。通过曲线的斜率能获得与抑制剂的浓度获得A，结果显示：A值与SNP突变体二体解离存在正相关关系。由此看出：人脑型肌酸激酶SNP突变体二聚体解离与活性之间存在一定的相关性。同时，人脑型肌酸激酶SNP突变后将会产生可逆的氧化状态，并且这种修饰能引起蛋白质结构的变化，并且如果得不到及时有效的控制，又会引起进一步氧化或其他类型的修饰产生[16]。

本课题研究了26、36、59级267位氨基酸发生突变的人脑型肌酸激酶SNP突变体活性与二体稳定性的关系，结果显示：H26Y、P36T和T59I氨基酸更加容易发生解离，二体的解离与酶功能丧失呈正相关性。由于空间排阻效应影响二体形成蛋白质的折叠途径，导致SNP突变及动力学差异显著（P<0.05）。由此看出：人脑型肌酸激酶SNP突变体二聚体解离与活性之间存在明显的相关性，通过测定人脑型肌酸激酶水平能了解患者的病情，指导临床治疗，使得患者的治疗更具针对性[17]。

但是，本课题研究过程中尚存在很多不足，一方面标本在测定时存在过多的累积误差，另一方面本研究属于是一个全新的领域，研究过程中存在的难度相对较大，对于试验结果的准确性及可靠性有待进一步研究和探讨。综上所述，人脑型肌酸激酶SNP突变体二聚体解离与活性间存在一定的相关性，用于一些疾病诊断中效果理想，为临床治疗提供依据和参考。

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