脓毒症性急性肾损伤与线粒体功能障碍

蒋 静 赵宇亮 付 平

脓毒症指宿主对感染反应失调而引起危及患者生命的器官功能障碍[1]，其发病率及病死率高，严重威胁患者生命安全，是目前一个主要的公共卫生问题。它可引起感染性休克或全身多器官衰竭综合征(MODS)，其中最易累及肾脏，引起急性肾损伤(AKI)又可促进脓毒症患者死亡。临床中合并脓毒症性AKI(SAKI)的患者预后较差。既往认为SAKI是脓毒症休克时肾脏低灌注及血管收缩所致，但研究发现在肾脏血流灌注正常甚至增加的情况下也可发生AKI，且以小管上皮细胞损伤为主，而非坏死和凋亡[2]，这促使我们重新审视对SAKI的传统理解。线粒体是由两层膜包被的细胞器，存在于大多数细胞中，是细胞进行有氧呼吸及产生能量的主要场所。线粒体除进行能量代谢外，还参与调节膜电位、控制细胞凋亡、调控细胞代谢与增殖、调控钙信号、参与细胞信号传导等生物过程。近年来的研究表明线粒体功能障碍在SAKI发病过程中起着重要的作用，且SAKI的恢复也依赖于线粒体结构和功能的恢复，这些为寻找SAKI新的治疗靶点提供了研究方向。本文将通过描述SAKI中线粒体动力学改变、线粒体自噬、线粒体再生、线粒体通透性转换、线粒体诱导凋亡等方面，进一步探讨线粒体功能障碍和SAKI之间的关系。

SAKI中线粒体形态和功能改变

肾脏占人体重量的0.5%，但耗氧量高，占机体总耗氧量的10%。肾脏含有丰富的线粒体，其分布密度仅次于心脏。肾脏对能量的需求高，以满足对溶质的不断转运，而这又依赖于线粒体氧化磷酸化提供充足的ATP[3]。也正因如此，在缺血、缺氧情况下，肾脏容易因线粒体功能障碍而损伤。许多AKI实验模型中可见线粒体形态及功能的改变，提示线粒体功能紊乱在AKI发病中起重要作用。

线粒体的动力学改变线粒体是处于高度动态过程中的细胞器，在生理状态下不断分裂和融合，保持动态平衡，即线粒体的动力学。它既可彼此融合形成管网状结构，也可分裂成片段化结构。多个信号分子参与了线粒体动力学变化的调节，如线粒体的融合依赖位于线粒体外膜(MOM)的线粒体融合蛋白1(mitofusion-1，Mfn-1)、线粒体融合蛋白2(mitofusion-2，Mfn-2)、位于线粒体内膜(MIM)的视神经萎缩蛋白1(optic atrophy-1,Opa-1)以及动力相关的GTP酶等；而线粒体的分裂依赖动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp-1)和分裂蛋白1(fission protein-1，Fis-1)(图1)。

图1 线粒体形态学平衡线粒体融合和分裂的形态学平衡维持线粒体的正常功能，Mfn1/2、Opa-1等分子介导线粒体融合，而Drp-1等介导了线粒体分裂。当线粒体出现过度分裂时，可出现线粒体功能障碍，进而引起细胞乃至组织器官水平的功能障碍。Mfn-1/2：线粒体融合蛋白1/2;Opa-1：视神经萎缩蛋白1;Drp-1：动力相关蛋白1

适度的线粒体融合有利于线粒体之间的能量传递、信号交流和DNA互补，而线粒体分裂可明确线粒体之间的界限和分工，清除受损线粒体，发挥线粒体质量控制的作用[4]。在生理状态下，线粒体的融合与分裂受到精确调控，彼此平衡，这不仅可维持线粒体的正常形态，还对线粒体DNA(mt DNA)的完整性、细胞能量代谢、细胞的增殖与死亡及功能稳态的维持至关重要。一旦打破这种平衡，可导致线粒体及细胞损伤。如分裂过度或融合受阻可致线粒体碎片化(MF)，继而引起线粒体肿胀破裂、凋亡信号如细胞色素c释放、ROS激活、线粒体膜通透性改变等。在2009年，Brooks等[5]发现MF出现在AKI极早期，缺血及顺铂干预4h后超过25%的肾小管上皮细胞中出现MF，先于肾小管上皮细胞损伤的出现，且此过程随时间推移而变化。

Gall等[6]在AKI小鼠模型中发现，Mfn-2表达受抑，线粒体会出现更明显的分裂和细胞凋亡；在顺铂诱导的AKI模型中发现，Drp-1从胞质转移至线粒体外膜结合点可诱导线粒体分裂,下调Drp1和SiRNA表达可抑制MF，减少线粒体损伤、细胞凋亡和肾脏损伤。此外,线粒体分化抑制因子1(mitochondria l division inhibitor-1，Mdivi-1)，作为Drp-1的一种抑制剂，可通过抑制Drp-1表达而抑制MF，从而保护肾脏；在甘油诱导的AKI模型中也报道了与Mdivi-1相似的肾脏保护效应[7]。研究表明，Bak和Bax，Bcl-2家族中的促凋亡因子，也参与了线粒体动力学的调节。应激状态下，Bak与Mfn-2分离而与Mfn-1结合，诱导MF发生。Bak和Bax参与了线粒体碎片化、线粒体通透性改变等过程。上述研究表明线粒体动力学稳态的维持对线粒体功能、细胞内环境和细胞活性的维持至关重要[8]。线粒体动力学紊乱在AKI的线粒体功能障碍、肾小管细胞损伤和凋亡中有着不可忽视的作用。

线粒体自噬生理状态下，自噬是机体的一种自我监测和保护反应，主要负责营养物质的转换、回收利用以及清除损伤或无功能细胞器。过度的自噬会消化细胞中的正常成分而引起细胞损伤和死亡，而自噬不足可致受损细胞器不能及时清除而累积，释放细胞色素c、活性氧等物质引起细胞损伤甚至死亡。在2012年，Hsiao等[9]在盲肠结扎穿孔(CLP)后诱导发生的SAKI小鼠模型上证实了线粒体自噬在干预早期即被激活，3h开始升高，但在9h后又下降，18h后出现 AKI；自噬反应被抑制的动物其预后较差，而外源性激活自噬可促进肾脏功能恢复[8]。以上提示自噬的激活或抑制与细胞损伤、器官功能和结局相关。研究显示在NPK-52E小管细胞中，抑制线粒体自噬会增加肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的细胞死亡。Howell等[10]发现替西莫司(mTOR 抑制剂)可诱导自噬的发生，阻止SAKI的进展。

无论是在正常或疾病状态下，清除受损的细胞器尤其是受损的线粒体对于机体维持正常功能十分重要。损伤的线粒体释放出细胞色素c、产生活性氧簇(ROS)、mtDNA等，引起强烈的免疫或炎症反应，导致细胞损伤和死亡。在肾脏缺血再灌注时，BNIP3相应上调，提示线粒体自噬在AKI中可能受HIF-1/BNIP3信号通路的调节。Parikh等[8]发现在脓毒症患者的肾脏组织中可观察到肾小管上皮细胞的线粒体嵴损伤、线粒体肿胀，同时伴有自噬溶酶体的增加，表明SAKI发生时清除小管上皮细胞中损伤线粒体的自噬过程也随之发生。

以上研究表明，线粒体自噬出现在SAKI的早期以发挥肾脏保护作用，但在应激或病理条件下其保护机制仍不清楚。且随着疾病的进展，选择性自噬和质量控制受到抑制，引起损伤线粒体的堆积、氧化应激和细胞死亡。

线粒体再生线粒体的再生指mtDNA的复制并产生新的线粒体，新产生的线粒体可替代损伤的线粒体发挥生物功能，避免受损线粒体的堆积引起一系列反应继而导致细胞损伤。线粒体的再生过程很复杂，比如核信号与线粒体反应配对就复杂而精细。损伤、锻炼、寒冷刺激等因素均可通过NOS/cGMP、p38MAPK、SIRT1、AMPK等信号通路刺激线粒体的再生[11]，这个过程还涉及到过氧化物酶体增殖激活受体(PPARs)、雌激素相关受体(ERRs)、PPARr辅激活因子(PGC-1α)等核激素受体的激活。其中PGC-1α是线粒体再生的一个正性调节因子[3]。PGC-1α的表达受ATP消耗、缺氧、ROS及NO等因素的影响。研究显示，PGC-1α多表达于代谢活跃的器官，如大脑、心脏、骨骼肌、肾脏；在肾脏中，属小管上皮细胞表达最高。氧化应激致肾脏近端小管损伤时，PGC-1α表达增加，而过表达或上调PGC-1α可促进线粒体功能障碍的恢复。过表达PGC-1α或通过药物调节PGC-1α的信号通路SIRT1可延缓线粒体和细胞的损伤。在CLP或内毒素血症模型中发现PGC-1α在肾脏的表达下降，这可能是由于肾小球滤过率下降时离子转运减少及能量的消耗下降导致PGC-1α的激活减少。以上研究表明线粒体再生的正性调节因子PGC-1α可能参与了SAKI肾脏细胞的恢复，线粒体的再生可能成为SAKI未来的治疗靶点。

线粒体通透性转换线粒体通透性转换孔(MPTP)是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是一种非特异性通道，可允许分子量较小的离子自由通过，通过氧化磷酸化来驱动ATP合成酶，以维持线粒体的膜电位和细胞内外的离子平衡。MPTP持续开放可引起线粒体通透性改变，导致线粒体膜电位的消失、细胞内外离子失衡、内膜完整性的改变、线粒体肿胀破裂等，继而释放一系列因子诱导细胞死亡，促进AKI的发生。Morales等[12]在庆大霉素诱导的AKI模型中发现，肾脏损伤6d后即观察到了线粒体缺乏呼吸和MPTP开放的现象。而抑制线粒体的通透性改变，可以减轻AKI，提示线粒体通透性改变可能参与了AKI的发生。Szeto等[13]发现SS-31可通过减少ROS产生、抑制线粒体通透性的改变而维持膜的完整性和线粒体的形态，从而减轻肾脏损伤。

线粒体诱导凋亡MPTP与细胞的凋亡密切相关，在细胞受刺激时线粒体通透性发生改变，MPTP持续高水平开放，可引起2种结局：(1)一系列导致细胞死亡的事件发生，如：细胞内外离子平衡紊乱、氧化磷酸化解耦联、ATP水平迅速下降等；(2)膜电位去极化，基质肿胀使膜间蛋白如细胞色素c、凋亡诱导因子等释放入胞质，通过启动半胱天冬氨酸蛋白酶依赖性或非依赖性的级联反应机制，诱导细胞凋亡。线粒体通过自噬减轻损伤线粒体的堆积，防止ROS等物质的释放；ROS超载可导致电子传递链功能障碍、线粒体膜通透性改变及细胞色素c释放而诱导细胞凋亡，而线粒体膜破裂进一步使ROS及其他凋亡因子释放增加，形成恶性循环，促进细胞凋亡的发生。

mtDNA的毒性作用Tsuji等[14]提出mtDNA可通过Toll样受体9(TLR9)在一定程度上导致SAKI发病。mtDNA可通过TLR9激活炎症反应而引起肾脏损伤。在TLR9-KO的小鼠模型中，血浆mtDNA水平低，且炎症反应弱；静脉注入含mtDNA的线粒体残骸可快速诱导炎症反应应答，随之出现肾脏损伤[15]。由TNF受体和Toll样受体介导的局部炎症反应也与SAKI发病有关。以上表明mtDNA通过TLR9介导的炎症反应可能在SAKI发病过程中扮演着重要角色。

SAKI的线粒体治疗靶点

线粒体损伤是多种AKI模型中早期即可观察到的病理生理改变，保护线粒体作为一种极具前景的治疗策略受到学界关注。目前在线粒体靶向治疗方面已取得一定的进展，主要的治疗手段包括抑制线粒体通透性转换(MPT)和凋亡信号通路、抗氧化剂的使用、抑制过度分裂、促进自噬和线粒体再生等[16-18]，具体的干预靶点及相关药物见表1。

表1 脓毒症性急性肾损伤线粒体干预靶点

AMPK：腺苷酸活化蛋白激酶;Drp-1:动力相关蛋白1;Mfn-2:线粒体融合蛋白2;ROS:活性氧;AICAR:5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸;Mdivi-1:细胞渗透的线粒体分裂发动蛋白相关GTP酶(DRP1)和线粒体分裂发动蛋白I(Dnml)选择性抑制剂;PGC-1a/SIRT3:过氧化物增殖子激活-受体因子y辅激活因子/沉默信息调节因子2相关酶3;Parkin:由PARK2基因编码的一种蛋白;Ambra1:是一种自噬相关基因

通过药物或基因手段抑制线粒体的分裂可保护肾脏。在多种AKI动物模型中显示Mdivi-1可抑制线粒体分裂，延缓小管细胞的凋亡及AKI的进展。而最近的研究也显示敲除近端小管的Mfn-2可促进肾脏功能的恢复[19]。

在内毒素血症小鼠模型的研究中发现,PGC-1α敲除组和野生组间肾功能的基线是无差异的，但是敲除组GFR持续下降，提示PGC-1α可能参与SAKI的恢复。而Morigi等[20]在顺铂诱导的AKI小鼠模型中发现，AMPK的兴奋剂AICAR可通过激活PGC-1α增加SIRT3的表达，促进小管上皮细胞中线粒体的生成，延缓小管的损伤。他们还发现，乙酰左旋肉碱可通过抗线粒体氧化应激延缓肾小管的损伤，改善肾功能。

Gao等[21]发现虎杖苷可通过抑制脂质过氧化物的产生、稳定溶酶体、抑制线粒体通透性转换孔的开放、抗炎等减轻肾脏组织损伤，改善肾脏的功能，延长小鼠寿命。

最近也有研究显示脓毒症发生线粒体功能受损时，人类重组碱性磷酸酶(recAP)是通过抑制炎症反应而非影响氧耗保护肾小管上皮细胞。

在脂多糖(LPS)诱导的SAKI小鼠模型中，依达拉奉不仅可抑制LPS诱导的TNF-α和IL-6等炎症因子产生，阻止线粒体膜电位的丢失，逆转T-AOC、SOD、CAT、GSH和线粒体MDA，而且可抑制线粒体的分裂和肾脏细胞的凋亡，继而发挥肾脏保护作用。地塞米松减轻脓毒症所致的AKI也在几个体外和体内模型中得到证实，包括减少细胞因子及iNOS的释放，改善残余肾功能，抑制促凋亡蛋白的产生及减少线粒体的损伤等。TJJ等[22]也在LPS诱导的模型中发现，地塞米松可酸化细胞内环境，减轻线粒体功能障碍，改善线粒体呼吸复合物V的活性和表达，减少ROS的产生，促进线粒体功能的恢复。地塞米松的这些作用并非通过PGC-1α诱导的线粒体合成介导，而可能与细胞内pH的恢复有关。在CLP诱导的SAKI模型中，卡维地洛可延缓线粒体中的谷胱甘肽和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脱氢酶的下降而起到肾脏保护作用。

Cui等[23]和Jiang等[24]发现通过氯喹或敲除小鼠肾脏近端小管细胞的Atg7可抑制线粒体自噬而加重顺铂诱导的AKI，而可促进自噬的雷帕霉素则可减轻顺铂的肾毒性，但与此同时也会抑制AKI的恢复。研究显示，抗霉素A或黏噻唑，作为线粒体呼吸复合物的一种抑制剂，不仅可延缓顺铂诱导的p53激活，而且可保护肾小管细胞。Ambra 1也因可诱导自噬而可能成为一种治疗手段。

再如，环孢素A通过抑制MPT、线粒体分裂、Bax的累积、细胞色素c的释放及凋亡等发挥肾脏保护效应，但也因其肾毒性限制了它的应用。小鼠的CypD基因敲除在肾脏缺血损伤中可表现出保护效应[25]。

总结与展望：AKI的发病机制复杂，且常有多种因素参与，但最常见的发病原因是由革兰阴性菌产生内毒素所引发的脓毒症[26]。肾脏是脓毒症最常见的靶器官之一，SAKI的发病率和病死率居高不下，目前尚无特异的治疗手段能治愈AKI，亟待寻找新的治疗靶点。研究显示线粒体动力学改变、线粒体自噬、再生、线粒体通透性转换、线粒体诱导凋亡等参与了SAKI的发病。针对线粒体功能障碍的治疗靶点已取得一定的进展，主要包括抑制线粒体通透性转换和凋亡信号通路、抗氧化剂的使用、抑制过度分裂、促进自噬和线粒体再生等。今后仍需进一步深入研究线粒体功能障碍与SAKI之间的具体机制，以利于继续寻找线粒体的靶向治疗手段，帮助临床早期诊治SAKI，提高患者的生存率，改善患者的预后。

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