常规PCR法扩增口蹄疫病毒基因组5’端序列的探索

朱 研，苗书魁，马文戈，李金娜，魏玉荣，汪 萍，魏 婕，米晓云，黄 炯

(1新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，乌鲁木齐 830011)

0 引 言

【研究意义】口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)被世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)列为法定上报的动物疫病，被我国农业部列为一类疫病[1]。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、AsiaⅠ共7个血清型，目前全球主要流行O型和A型FMD，其次为AsiaⅠ型和SAT2型，其中O型危害最为严重[2]。我国O型FMD主要流行3个拓扑型，为Cathay 拓扑型(古典中国型)、SEA拓扑型(东南亚拓扑型)和ME-SA拓扑型(中东-南亚拓扑型)。FMDV RNA约由8 500个核苷酸( nucleotides，nt)的无囊膜单股线状正链RNA组成，包括约1 300 nt的5’非编码区(5’untranslatedregion，5’UTR) 、约6.5 kb的1个大的开放阅读框(open reading frame，ORF) 、约90 nt的3’非编码区(3’untranslatedregion，3’UTR)及poly(A)组成[3]。在口蹄疫RNA基因组5’末端有一个特殊的小蛋白(VPg)，通过磷酸二酯键与尿嘧啶残基相连[4]。紧接着的5’UTR由1个约360 nt可折叠成茎环结构的S片段、1个约100-420 nt的聚胞嘧啶poly(C)片段和1个可形成许多二级结构的L片段及其它部分组成[5]，与启动多聚蛋白的翻译和病毒的复制有重要作用[6]。FMDV 5’端二级结构复杂，且有VPg(3B)蛋白、S片段、poly(C)等的存在，PCR时很难扩增出5’端的序列。试验用常规的PCR法扩增5’端的序列，为FMDV反向遗传学研究奠定基础。【前人研究进展】对于FMDV 5’端序列的扩增，研究者采用了不同的方法。有人先提取FMDV的RNA，再将其反转录成cDNA，最后扩增出5’端序列[7-9]。自1988年Frohman等报道cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)以来[10]，有学者[11-12]用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法成功扩增出FMDV的5’端序列。袁子文等[13]采用融合PCR得到FMDV 5’端序列；仝燕许等[14]以特异性引物反转录扩增获得FMDV 5’端的S片段和E片段，再通过融合PCR得到SE片段。【本研究切入点】通过设计不同的反转录引物及扩增引物，采用常规PCR方法，以不同的扩增酶对FMDV O/Akesu/58 CE39A株的5’末端序列进行扩增。【拟解决的关键问题】探索以更简便有效的常规PCR法，扩增出FMDV 5’端序列所需的条件，为RNA病毒 5’端序列的扩增提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒及细胞

新疆畜牧科学院兽医研究所将1958年采自新疆阿克苏牦牛的一株O型口蹄疫病毒，经鸡胚传代驯化39代致弱为安全的毒株，命名为O/Akesu/58 CE39，筛选的单克隆毒株命名为O/Akesu/58 CE39A。O/Akesu/58 CE39A基因组RNA自1990年代由新疆畜牧科学院兽医研究所保存于液氮中。

BHK-21由该实验室保存，大肠杆菌感受态细胞DH5α购自天根生化科技(北京)有限公司，pMD19-T Vector购自TaKaRa公司。

1.1.2 主要试剂

LATaqDNA polymerase、EXTaqDNA polymerase、PrimeSTAR®HS DNA polymerase，cDNA Synthesis Kit购自Roche公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计

根据GenBank中O型FMDV全基因组序列(GenBank 登录号：AJ539138)，设计5’端反转录引物(a、b、c)及扩增引物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，由新疆昆泰锐生物技术有限公司合成。表1

表1 O/Akesu/58 CE39A株5’端序列的反转录引物和扩增引物
Table 1 Primers for reverse and amplification of the 5’ terminal sequences of the O/Akesu/58 CE39A strain

引物Primers位置Nucleotideposition序列(5’-3’)Sequences(5’-3’)a3’末端TTTTTTTTTTTTTTTTTTb776AGTTCCCGCGGCCACCATGCTCc2960GGCGTATGCAATCATGTAACGⅠ1F:TTGAAAGGGGGCGTTAGGG767R:CCACCATGCTCCGCTACGAAGⅡ1F:TTGAAAGGGGGCGTTAGGGT776R:AGTTCCCGCGGCCACCATGCTCⅢ1F:TTGAAAGGGGGCGTTAGG782R:TGCTGGGGTTGCACACAT

注：F:上游引物，R：下游引物

Note:

1.2.2 RNA纯度测定

取液氮中保存的FMDV O/Akesu/58 CE39A RNA 10 μL，加990 μL ddH2O,混匀，于紫外分光光度计测定其核酸纯度。

1.2.3 反转录

以反转录引物a、b、c分别进行反转录得到扩增模板cDNA1、cDNA2、cDNA3。

1.2.4 5’端序列的扩增

1.2.4.1 采用不同扩增引物及酶对5’端扩增

以cDNA1、cDNA2、cDNA3为模板，分别以扩增引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及不同的DNA聚合酶LATaq、 EXTaq、PrimeSTAR对5’端序列进行扩增，列出试验设计方案。表2

1.2.4.2 常规PCR退火温度的优化

参照引物合成的建议Tm值，拟设计退火温度55、60和65℃对表2试验分别进行扩增，确定最佳Tm。各扩增条件如下：

①94℃预变性2 min；94℃ 30 s,55℃ 20 s,72℃ 55 s进行30个循环；最后72℃延伸10 min。

②94℃预变性2 min；94℃ 30 s,60℃ 20 s,72℃ 55 s进行30个循环；最后72℃延伸10 min。

③94℃预变性2 min；94℃ 30 s,65℃ 20 s,72℃ 55 s进行30个循环；最后72℃延伸10 min。

表2 O/Akesu/58 CE39A株5’末端的扩增
Table 2 Amplification of the 5’ terminal of the O/Akesu/58 CE39A strain

TaqDNA聚合酶TaqDNAPolymerase模板 TemplatescDNA1cDNA2cDNA3LATaqⅠⅠⅠⅡⅡⅡⅢ—ⅢEXTaqⅠⅠⅠⅡⅡⅡⅢ—ⅢPrimeSTARHSⅠⅠⅠⅡⅡⅡⅢ—Ⅲ

1.2.5 目的基因克隆及鉴定

将PCR产物克隆至pMD19-T载体，转化至感受态细胞DH5α，在LB培养基中过夜培养，提取质粒，通过酶切及测序鉴定，得到阳性质粒。

1.2.6 PCR灵敏度的检测

对能成功扩增出5’端序列的阳性cDNA以10倍梯度稀释，稀释范围为100～10-6，以这7个浓度的cDNA为模板，取相应扩增成功的引物及扩增酶进行三组重复的常规 PCR，同时以无菌去离子水为模板做阴性对照。将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并拍照，确定模板的最大稀释度。

2 结果与分析

2.1 RNA纯度测定

以分光光度计测得O/Akesu/58 CE39A株基因组RNA A260/A280为1.871，表明此RNA中可能有部分蛋白质或其它有机物的污染，或是完整RNA降解导致纯度降低，但在允许范围1.8～2.0之内。

2.2 以不同的模板和酶扩增5’端序列

2.2.1 cDNA1模板扩增结果

用不同酶及扩增引物对5’端序列进行扩增，结果显示，以cDNA1为模板，用各扩增酶LATaq、EXTaq、PrimeSTAR及扩增引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在55℃、60℃、65℃退火温度下进行PCR，均未扩增出预期大小条带。表3

表3 以cDNA1为模板的扩增结果
Table 3 The results of amplification of cDNA1 template

引物PrimersTaqDNA聚合酶TaqDNAPolymerasePCR程序PCRprocedure是否扩增成功ResultsLATaq①、②、③①否、②否、③否ⅠEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否LATaq①、②、③①否、②否、③否ⅡEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否LATaq①、②、③①否、②否、③否ⅢEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否

2.2.2 cDNA2模板扩增结果

用不同酶及扩增引物对5’端序列进行扩增，结果表明，以cDNA2为模板，用EXTaq、PrimeSTAR扩增酶及扩增引物Ⅰ、Ⅱ在各退火温度下进行PCR，均未扩增出目的条带。但在LA酶作用下，两对引物均扩增出预期大小条带。在55及60℃退火温度下，扩增出的目的条带与弥散带混杂，将退火温度提高至65℃，可扩增出清晰的目的条带，表明在LA酶下，以cDNA2为模板扩增FMDV 5’端序列的最佳退火温度为65℃。表4，图1～3

2.2.3 cDNA3模板扩增结果

用不同酶及扩增引物对5’端序列进行扩增，结果显示，以cDNA3为模板，用3种扩增酶及3对扩增引物对5’端进行扩增，均未扩增出目的条带。表5

2.3 重组质粒的酶切鉴定

以cDNA2为模板，将LATaqDNA polymerase及扩增引物Ⅰ、Ⅱ下的PCR产物克隆至pMD19-T载体，转化至DH5α感受态细胞，提取质粒pMD19-T-Ⅰ、pMD19-T-Ⅱ，将质粒用BamH Ⅰ和SalⅠ进行双酶切鉴定，设无插入片段空质粒pMD19作为对照，以1%琼脂糖凝胶电泳分析，均得到预期大小的条带，表明该质粒为阳性质粒。图4

表4 以cDNA2为模板的扩增结果
Table 4 The results of amplification of cDNA2 template

引物PrimersTaqDNA聚合酶TaqDNAPolymerasePCR程序PCRprocedure是否扩增成功ResultsLATaq①、②、③①是、②是、③是ⅠEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否LATaq①、②、③①是、②是、③是ⅡEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否

注：M：GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：引物Ⅰ的PCR产物； 2：引物Ⅱ的PCR产物

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The PCR products by primer Ⅰ; 2: The PCR products by primer Ⅱ

图1 引物Ⅰ、Ⅱ在55℃退火温度下PCR结果
Fig.1 The PCR results of amplification at 55℃ annealing temperature with primer Ⅰ, primer Ⅱ

注：M：GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：引物Ⅰ的PCR产物； 2：引物Ⅱ的PCR产物

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The PCR products by primer Ⅰ; 2: The PCR products by primer Ⅱ

图2 引物Ⅰ、Ⅱ在60℃退火温度下PCR结果
Fig.2 The PCR results of amplification at 60℃ nnealing temperature with primer Ⅰ, primer Ⅱ

注：M：GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：引物Ⅰ的PCR产物；2：引物Ⅱ的PCR产物

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The PCR products by primer Ⅰ; 2: The PCR products by primer Ⅱ

图3 引物Ⅰ、Ⅱ在65℃退火温度下PCR结果
Fig.3 The PCR results of amplification at 65℃ annealing temperature with primer Ⅰ, primer Ⅱ

注：M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：空质粒pMD19-T(2692 bp)；2：pMD19-T-Ⅰ的酶切产物(2692 bp+787 bp)；3：pMD19-T-Ⅱ的酶切产物(2692 bp+797 bp)

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: Empty plasmid pMD19-T(2692 bp); 2: Digestion of pMD19-T-Ⅰ positive clone(2692 bp+787 bp); 3: Digestion of pMD19-T-Ⅱ positive clone(2692 bp+797 bp)

图4 O/Akesu/58 CE39A株5’末端重组质粒的酶切鉴定
Fig.4 Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid of 5’ termini, O/Akesu/58 CE39A strain表5 以cDNA3为模板的扩增结果
Table 5 The results of amplification of cDNA3 template

引物PrimersTaqDNA聚合酶TaqDNAPolymerasePCR程序PCRprocedure是否扩增成功ResultsLATaq①、②、③①否、②否、③否ⅠEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否LATaq①、②、③①否、②否、③否ⅡEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否LATaq①、②、③①否、②否、③否ⅢEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否

2.4 重组质粒的测序

将酶切鉴定的阳性质粒进行测序，测序结果在DNAMAN软件中进行比对，结果显示，分别以引物Ⅰ、Ⅱ对O/Akesu/58 CE39A株5’末端进行扩增，所测得的序列787 bp、797 bp与参考序列(GenBank 登录号：AJ539138)5’末端的核苷酸同源性为86.2%和86.3%，再次证明得到的质粒为阳性质粒。

2.5 常规PCR灵敏度的检测

以LATaqDNA polymerase为扩增酶，以7个浓度的cDNA2为模板，分别用扩增引物Ⅰ、Ⅱ做常规PCR。扩增条件如下：94℃预变性2 min；94℃ 30 s,65℃ 20 s,72℃ 55 s进行30个循环；最后72℃延伸10 min。结果表明，在引物Ⅰ的电泳图中，稀释度≤10-3时能观测到目的条带，稀释度≥10-4时没有条带，阴性对照没有条带；在引物Ⅱ的电泳图中观察到相同的结果。因此，引物Ⅰ、Ⅱ可检测到的模板最大稀释度为10-3。图5，图6，表6

注：M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：100稀释度PCR产物；1～7：100～10-6稀释度PCR产物；8：阴性对照的PCR产物

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The PCR product by dilution 100; 1-7: The PCR products by dilution 100-10-6; 8: The PCR products of negative control

图5 引物Ⅰ在各浓度cDNA2模板下的PCR结果
Fig.5 The PCR results of each concentration of cDNA2 template with primer Ⅰ

注：M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：100稀释度PCR产物；1～7：100-10-6稀释度PCR产物；8：阴性对照的PCR产物

M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The PCR product by dilution 100; 1-7: The PCR products by dilution 100-10-6; 8: The PCR products of negative control

图6 引物Ⅱ在各浓度cDNA2模板下的PCR结果
Fig.6 The PCR results of each concentration of cDNA2 template with primer Ⅱ表6 常规PCR灵敏度测定结果
Table 6 Results of general PCR for the sensitivity determination

模板浓度Concentrationoftemplate10010-110-210-310-410-510-6引物Ⅰ PrimerⅠ++++---引物Ⅱ PrimerⅡ++++---

3 讨 论

口蹄疫病毒分为七个血清型，其中O型以拓扑型众多、免疫原性弱著称[2]。新疆畜牧科学院兽医研究所于1958年自阿克苏牦牛分离到一株O型口蹄疫病毒，该毒株被国家口蹄疫参考实验室命名为O/Akesu/58[15](GenBank 登录号：AF511039)，新疆畜牧科学院兽医研究所将该毒株经鸡胚传代驯化39代致弱为安全的毒株，命名为O/Akesu/58 CE39A，并曾经于上世纪90年代作为弱毒疫苗应用于口蹄疫预防与控制。O/Akesu/58 CE39A基因组与O/Akesu/58核苷酸同源性仅为86.4%，反而与O1/manisa iso87的核苷酸同源性达到了90.2%。

FMDV基因组5’末端结构复杂，其5’UTR 360 nt的S片段可形成发卡结构，距5’末端约350-500 nt处，有100-420 nt的poly(C)结构，其长度随毒株的不同而大小不一。在S片段和poly(C)下游可以形成许多高度保守的二级结构，该二级结构由串联重复的假结(PKs)结构、“发卡状”的RNA复制相关顺式作用元件(cre)结构和内部含“三叶草”状的内部核糖体进入位点(IRES)构成[16]。尽管其它病毒5’端也含有复杂的二级结构，但只有在FMDV 5’端会同时出现各种结构[17]，导致很难扩增出FMDV 5’端的序列。

5’端序列的扩增，有多种方法可供选用，如5’RACE法和染色体步移法。5’RACE试剂盒包括“去帽法”原理的环化技术模板跳转反转录的SMART RACE技术、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)加尾的锚定RACE等[18]，但这些试剂盒价格昂贵，操作过程繁琐，对模板的结构要求高[19]，只有对很难扩增的序列，才使用上述RACE试剂盒。染色体步移法包括反向PCR法、连接介导PCR法及特异引物PCR法[20-22]，这些方法操作复杂，对操作人员的技术要求较高，成功率较低。近年来，有的学者通过融合PCR 技术得到FMDV全长cDNA的克隆，从而获得5’端的序列[13-14]。试验选用常规PCR法，通过不同的扩增酶及不同的反转录模板、特异性PCR引物对5’端序列进行了扩增，该方法不需要耗费大量的时间与精力，操作简便，价格便宜，适宜条件下扩增成功率较高，可针对性的对5’端的序列进行扩增。

DNA聚合酶有多种，每种酶各有其特性。在PCR时，酶的选择至关重要，选用不同的酶进行扩增，结果可能截然不同，其最终结果需要经过具体试验来验证。由表4可知，在相同模板、引物、PCR条件下，以3种不同的Taq酶进行PCR，结果只有LATaq酶能扩增出目的片段，说明试验中该酶的扩增能力大于EXTaq和PrimeSTAR。

试验在参考序列的不同位置(3’末端、776～797、2 960～2 979)设计了三条反转录引物，分别反转录后得到三种模板(cDNA1、cDNA2、cDNA3)，以这三种模板分别进行PCR，结果发现，只有以cDNA2为模板，才能扩增出目的片段787 bp和797 bp，787 bp下游引物的位置，与反转录引物重合了一部分，797 bp下游引物的位置，与反转录引物位置完全重合。以cDNA1和cDNA3为模板均未扩增出目的片段，表明模板质量不够理想，或者模板长度对其结构有重要影响。

以cDNA为模板的常规PCR灵敏度检测表明，两对引物在模板稀释度≤10-3时均能扩增出5’端序列，但≥10-4时不能扩增出5’端序列。

试验在灵敏度检测时，未能计算出模板的最小拷贝数，仅确定了模板的最大稀释度，原因在于，病毒基因组RNA的反转录产物中，全长cDNA的拷贝数未知，且其中含有大量的非全长cDNA和其它残留物质(如残留的RNA、基因组等)。因此，仅通过反转录产物浓度的测定和计算稀释度的方法，并不能确定最大模板稀释度的PCR反应中全长cDNA拷贝数。试验使用到的病毒基因组反转录产物质量，影响因素复杂：第一，FMDV 5’末端结构复杂，存在茎环结构、假结结构等，难于反转录。第二，RNA质量的影响。FMDV RNA为单链结构，容易断裂，所提取的RNA中有断裂的RNA，直接影响了反转录产物的质量；不同批次间RNA质量差异也导致反转录产物的质量的不同。第三，反转录酶活性高时反转录效率高，反之低；第四，反转录体系的影响。如dNTP易降解，buffer中各成分浓度的影响等。第五，温度的影响。低温时会产生非特异条带，高温时可能会破坏RNA的二级结构。第六，FMDV RNA长约8 500 nt，基因组长，反转录引物有可能与模板上其它部位结合，产生大量非全长cDNA。

试验采用常规PCR法扩增FMDV 5’末端序列，通过不同模板、不同扩增酶、不同引物、不同PCR程序之间的比较，确定了扩增5’端序列的最佳条件，为FMDV复制机理、序列的扩增、结构与功能的关系、致病机理及宿主嗜性提供理论依据和技术支持。

4 结 论

常规PCR法扩增5’端序列较其它技术具有价格便宜、操作简便等优点。试验共进行了72次PCR，成功6次，成功率为6/72，在成功的6次中，2次扩增出了清晰的目的条带，其它4次都是目的条带与弥散带混杂，表明FMDV 5’端序列的扩增存在很大难度。常规PCR灵敏度检测表明，引物Ⅰ、Ⅱ可检测到的模板最大稀释度为10-3。

对类似FMDV 5’端难扩增的序列，为了保证模板的质量及扩增成功率，设计反转录引物时，可尽量在靠近该目的序列的3’端设计；设计PCR引物的下游引物时，可与反转录引物重合，或在靠近反转录引物的上游设计。

试验为FMDV 5’端序列的扩增奠定了基础，但对FMDV其它血清型及O型血清型其它株5’端序列的扩增，有待进一步的探索。

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