miR-204在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞凋亡的影响

陈 曦

(烟台市莱阳中心医院消化科，山东 烟台 265200)

据报道，我国胃癌的发病率和死亡率均居于世界前列〔1〕。目前胃癌的发病机制尚未明确，但已发现其与地域环境、饮食习惯、生活习惯、幽门螺杆菌感染、癌前病变、遗传、基因等有关〔2〕。微小RNA(miRNA)是一种广泛存在于真核生物中的RNA分子，可以介导细胞质中的RNA沉默复合物形成，降解细胞质中信使RNA，在转录后可对下游基因的表达进行调控，miRNA的表达与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关〔3〕。miRNA-204(miR-204)位于人类第9号染色体上，相关研究发现，miR-204在结直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤中呈现异常表达，可能参与了肿瘤的发展，但对于miR-204调控肿瘤发展的具体作用机制目前尚无定论〔4,5〕。本研究旨在探讨miR-204在胃癌组织中的表达及对胃癌细胞凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年6月至2017年3月在莱阳中心医院接受手术治疗的胃癌患者53例，收集其手术切除的胃癌组织作为胃癌组标本，并收集其癌旁(3 cm)正常组织作为对照组标本。纳入标准:①均经病理组织学确诊患有胃癌；②预计生存期超过3个月；③未接受过放化疗治疗者；④患者及其家属对本次研究知情同意。排除标准：①患有其他恶性肿瘤者；②临床病历资料不全者；③胃癌复发者。53例患者中男29例，女24例，年龄50～76岁，平均(67.4±5.7)岁，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期17例，分化程度：中高分化25例，低分化28例，有淋巴结转移31例，无淋巴结转移22例。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2细胞培养 人胃癌细胞株(BGC823、SGC7901)购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，永生化胃上皮细胞株(GES-1)购自上海细胞研究所。采用维森特生物技术(中国)有限公司生产的RPMI-1640培养基(含10% 小牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 mg/ml)作为细胞培养液，将其置于CO2恒温培养箱(ThrmoFisher公司)中培养，温度37℃，每2 d更换一次细胞培养液。

1.3逆转录- 聚合酶链反应(RT-PCR) 采用Trizol试剂提取胃癌组标本、对照组标本、BGC823、SGC7901、GES-1细胞株中的总RNA，逆转录成cDNA，引物序列由Invitrogen公司设计，具体如下：miR-204上游引物：5'-AACCUGAUCCCGUCUGAGAUUG-3'，下游引物：5'-CCGGAUCAAGAUUAGUUCGGUU-3'。以β-actin为内参，β-actin上游引物：5'-AGCGGGTCTGACGTAAAGCGA-3'，下游引物：5'-GTGGACGGGAGAGGAC-TGG-3'。PCR 反应条件：95℃预变性10 s，然后50个循环:95℃ 10 s，65℃ 8 s，60℃延伸8 s。根据扩增曲线确定Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-204的相对表达量。

1.4细胞转染 将miR-204加入至无RNA酶水(RNase-free水)，配成20 μmol/L的溶液。收集对数期的 BGC-823、SGC-7901细胞，胰酶消化后用培养基(含10%新生牛血清)进行培养，以2×105/ml 的细胞浓度接种于6孔板。加入lipo2000转染试剂，Opti-MEM稀释，静置5 min。将混合液滴加至细胞培养板中，每孔500 μl，4～6 h后换液。转染完成后加入4 μl的5-Fu溶液(50 ng/μl)，静置24 h，消化细胞。

1.5细胞增殖检测 采用四甲基耦氮唑盐法(MTS)检测转染miR-204和未转染miR-204人胃癌细胞株的增殖情况。消化并打匀各组贴壁细胞，将其移入96孔板中，每孔加入20 μl反应溶液，CO2恒温培养箱2 h，温度37℃。使用自动酶标仪(美国biotek公司)在490 nm波长处检测各组的吸光度。

1.6细胞凋亡检测 将细胞浓度调整为1×106/ml，在1 000 r/min离心10 min，舍去上清液，加入1 ml PBS缓冲液，轻微振荡，1 000 r/min，在4℃下3 000 r/min离心10 min，舍去上清液，采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，试剂盒购于上海前尘生物科技有限公司，所有操作均按照试剂盒说明书进行。采用Modifit 1.0软件分析细胞凋亡情况。

2 结 果

2.1胃癌组标本、对照组标本、BGC823、SGC7901、GES-1细胞株中的miR-204表达 胃癌组标本为(1.91±0.81)，对照组标本为(3.87±1.36)，两组比较差异有统计学意义(t=-9.014，P=0.000)。BGC823细胞株和SGC7901细胞株中的miR-204的相对表达量分别为(1.86±0.23)、(1.16±0.11)，均低于GES-1细胞株中的(5.27±0.64)，差异均有统计学意义(t=-36.504，-46.076；P=0.000，0.000)。

2.2胃癌组组织miR-204相对表达与临床病理参数的关系 胃癌组组织标本中miR-204相对表达量与患者的年龄、性别无关(P>0.05)，而与患者的TNM分期、淋巴结转移和分化程度有关(P<0.05)，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、低分化组的miR-204相对表达量明显低于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、中高分化组的相对表达量(P<0.05)。见表1。

表1 胃癌组织miR-204相对表达量与临床病理参数的关系

2.3miR-204对细胞增殖的影响 第1天，未转染组与转染miR-204组BGC823、SGC7901细胞株的吸光度比较差异均无统计学意义(P>0.05)；第3天，未转染组BGC823、SGC7901细胞株的吸光度高于转染miR-204组(P<0.05)。见表2。

表2 miR-204对细胞增殖的影响

2.4miR-204对细胞凋亡的影响 BGC823未转染组的细胞凋亡百分比为(8.26±0.38)%，低于转染miR-204组的(9.14±0.26)%，差异有统计学意义(t=6.044，P=0.000)；SGC7901未转染组的细胞凋亡百分比为(4.13±0.28)%，低于转染miR-204组 的(6.58±0.31)%，差异有统计学意义(t=6.044，P=0.000)。

3 讨 论

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，男性患者多于女性，在所有因恶性肿瘤导致死亡的患者中，男性胃癌患者的死亡率排在第三位，仅次于肺癌和肝癌，而女性胃癌患者的死亡率排在第二位，仅次于肺癌〔6〕。研究胃癌发生、发展相关的机制，对更好地预防和治疗胃癌具有重要的临床价值。已有研究报道探讨胃癌的发病机制，但目前尚无统一定论，多数观点认为胃癌的发病机制与B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、幽门螺杆菌感染、miRNA等有关〔7〕。miRNA是由特殊的小型非编码RNA组成RNA分子，这类RNA分子能够识别指定的目标mRNA，在转录后能抑制靶mRNA的翻译过程并促进其降解，进而调控基因表达，多种恶性肿瘤的发生、发展与其密切相关。严玉兰等〔8〕的研究指出，miRNA-143在非小细胞肺癌组织中的表达水平明显较癌旁组织降低，且miRNA-143的表达与淋巴结转移有关。郭晓东等〔9〕研究了miRNA-125在肝癌中的表达情况，结果发现肝癌组织中的miRNA-125含量明显低于正常肝组织。由此可见miRNA家族中多个成员与恶性肿瘤关系密切。miR-204是miRNA家族中的一员，近年来有研究指出其在肝癌、胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤中呈现低表达，并且能对肿瘤细胞的增殖、凋亡产生一定的影响〔10〕。

本研究结果显示，胃癌组织中miR-204的相对表达量低于癌旁正常组织，人胃癌细胞株中miR-204的相对表达量低于永生化胃上皮细胞株，这提示miR-204在胃癌组织或胃癌细胞株中呈现低表达，miR-204的表达水平可能会影响恶性肿瘤的发生、发展。进一步研究结果显示，胃癌组组织标本中miR-204相对表达量与患者的年龄、性别无关，miR-204在TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、低分化中的相对表达量明显低于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移、中高分化中的相对表达，这提示胃癌组组织标本中miR-204的表达与TNM分期、淋巴结转移以及分化程度有关。Sacconi等〔11〕的研究显示，胃癌患者血清中miR-204表达量显著低于健康对照组，且胃癌患者在经过手术治疗后血清miR-204表达量显著上调，且患者血清miR-204表达量与TNM分期、淋巴结转移、分化程度以及预后显著相关，这与本研结果类似，并且提示miR-204可作为衡量胃癌严重程度的血清学指标。本研究结果还显示，第3天未转染组BGC823、SGC7901细胞株的吸光度高于转染miR-204组，未转染组BGC823、SGC7901细胞株的细胞凋亡百分比显著低于转染miR-204组，这说明转染miR-204后可抑制胃癌细胞株的细胞增殖，并能促进其细胞凋亡。miR-204对肿瘤细胞增殖和凋亡的调控是多方面途径共同作用的结果，Wu等〔12〕的研究结果显示，miR-204能下调SOX4基因的表达，SOX4基因在多种恶性肿瘤中呈现高表达，能对肿瘤细胞的迁移、增殖、凋亡进行调控，因此这可能是miR-204影响肿瘤发展的途径之一。李扩等〔13〕的研究显示，miR-204在肝癌组织中表达下调，并且miR-204与 Bcl-2蛋白、组蛋白脱乙酰酶1(Sirt1)蛋白表达呈负相关(P<0.05)，因此推测miR-204可能通过抑制Bcl-2蛋白、Sirt1蛋白的表达来抑制肝癌细胞增殖和促进其凋亡，这也可能是miR-204对胃癌细胞进行调控的途径之一。周保贞等〔14〕的研究发现，幽门螺杆菌感染的患者血清miR-204的水平显著降低，提示miR-204与幽门螺杆菌感染也存在一定关系，但具体作用机制尚不明确。可以推测miR-204与胃癌的发生、发展密切相关，但其具体的作用机制还有待进一步研究探讨。

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12Wu D,Pan H,Zhou Y,etal.Upregulation of microRNA-204 inhibits cell proliferation,migration and invasion in human renal cell carcinoma cells by downregulating SOX4〔J〕.Mol Med Rep,2015;12(5):7059-64.

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