二陈汤对慢性支气管炎气道黏液高分泌的影响

尚立芝 吴 珂 谢文英 赵晓云 郜新莲 张 淼 梁娟娟 王 祎 亓照耀 徐莉莉

(河南中医药大学基础医学院，河南 郑州 450046)

随着大气污染和老龄化日益加重，慢性支气管炎的发病率、复发率呈剧增趋势〔1〕。本课题组经临床观察和前期动物实验研究证实，基于二陈汤的爱罗咳喘宁能明显改善慢性支气管炎患者和动物模型的咳、痰、喘等症状，但二陈汤治疗慢性支气管炎的作用及其机制不明〔2～7〕。本研究采用香烟烟雾加内毒素制备慢性支气管炎大鼠模型，观察二陈汤原方对大鼠支气管组织中与气道黏液分泌有关的黏蛋白(MUC)5AC、水通道蛋白(AQP)5蛋白表达的影响，探讨二陈汤对慢性支气管炎气道黏液分泌的作用及机制。

1 材料与方法

1.1药物、主要试剂与仪器 二陈汤方药物组成：姜半夏10 g(批号1309001H)、茯苓16 g(批号1309001H)、陈皮10 g(批号1302001H)、甘草6 g(批号1302001S)等为三九医药生产中药配方颗粒。脂多糖(L8880，701c034，Solarbio公司)，MUC5AC兔抗大鼠一抗试剂盒(bs-7166R)购自北京博奥森生物技术有限公司，AQP5兔抗大鼠一抗试剂盒(BA2205)购自武汉博士德生物工程有限公司。LEICA RM 2265全自动轮转切片机、LEICA EM UC7超薄切片机、HI1210摊片机(德国LEICA公司)，OLYMPUS显微摄像仪及图像采集系统(JAPAN 20486，TOKYO)，Motic数字切片扫描与应用系统等。

1.2实验动物与分组 山东鲁抗医药股份有限公司提供7～8月龄SPF级SD雄性大鼠60只，体重(250±20)g，合格证号SCXK鲁20130001。随机分为6组：正常组、模型组、二陈汤高、中、低剂量组组，急支糖浆组，每组10只。正常组和急支糖浆组无死亡，大鼠一般状况好，体重增加。模型组死亡2只，存活鼠体重下降。二陈汤高、中、低剂量组各死亡1只，存活大鼠体重稍增。

1.3制备模型 正常组不熏烟，第1和第14日经气管注入生理盐水200 μl。参照文献及前期研究〔8，9〕，采用熏香烟烟雾加气管注内毒素脂多糖制备慢支大鼠模型。实验第1、第14日，注入气管内200 μl内毒素脂多糖(1 mg/ml)。第2～13日，第15～28日将大鼠置于箱内熏香烟烟雾，香烟8支/次，30 min/次，2次/d。

1.4给药 依据肺功能检测和组织病理结果判断模型是否成功，模型制备成功后。参考文献〔10～12〕，急支糖浆组灌胃太极急支糖浆12 g/kg，二陈汤高、中、低剂量组9.80、4.90、2.45 g/kg，灌胃，稀释成6 ml，2次/d，3 ml/次。正常组及模型组生理盐水6 ml/d灌胃，连续14 d。

1.5标本制备 取气管、支气管组织，甲醛溶液固定、石蜡包埋，5 μm厚切片，常规HE染色，光镜下观察气管、支气管组织结构。

1.6MUC5AC和AQP5蛋白的原位表达及结果判断〔13〕免疫组化(IHC，S-P)检测主要步骤按试剂盒说明书操作进行。①切片脱蜡至水；②3%H2O2阻断内源性过氧化物酶；③羊血清封闭；④加第一抗工作液(1∶100)4℃孵育过夜；⑤加生物素化二抗工作液；⑥二氨基联苯胺(DAB)显色后苏木素复染。以磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作空白对照，已知阳性切片作为阳性对照。以棕黄色颗粒为阳性表达，不着色为阴性。用Olympus GX51全自动图像分析系统，每张切片随机选取400倍10个视野，分析阳性染色吸光度(A)的平均值。

1.7统计学处理 采用SPSS13.5软件进行方差分析及Spearman等级相关分析。

2 结 果

在正常组、模型组细支气管MUCSAC均有表达，阳性表达信号为胞质、胞膜的呈棕黄色，以胞质为主。与正常组比较，模型组MUC5AC蛋白表达明显增强；与模型组相比，二陈汤高、中剂量组MUC5AC蛋白表达均显著降低(均P<0.01)。在正常组、模型组细支气管AQP5有阳性表达，阳性信号为胞质棕黄色颗粒为主，细胞膜也有阳性；与正常组比较，模型组AQP5蛋白表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，二陈汤高、中剂量组AQP5蛋白表达均显著增强(均P<0.01)，见表1，图1，图2。经Spearman等级相关分析显示，在正常组AQP5蛋白与MUC5AC蛋白表达呈显著负相关(rs=-0.650,P<0.05)。在模型组(rs=-0.883,P<0.01)和二陈汤中剂量组(rs=-0.795,P<0.01)AQP5蛋白与MUC5AC蛋白表达呈非常显著负相关。而在二陈汤高(rs=-0.631,P>0.05)和低剂量组(rs=-0.583,P>0.05)AQP5蛋白与MUC5AC蛋白表达有负相关趋势，但相关性不显著。

表1 各组支气管组织中MUC5AC和AQP5蛋白的表达

与模型组比较：1)P<0.01

图1 各组细支气管组织MUC5AC蛋白表达(DAB，×100)

图2 各组细支气管组织AQP5蛋白表达(DAB，×100)

3 讨 论

慢性支气管炎与感染、过敏、寒冷、吸烟、空气污染及患者内在因素有关。上述病因刺激可直接或通过神经-内分泌引起支气管黏液腺分泌亢进，炎症反复刺激使呼吸道黏膜假复层纤毛柱状上皮损伤，黏液腺肥大、增生。脱落的黏膜、炎性渗出物与黏液混合形成黏液栓，是慢性支气管炎临床咳、痰、喘的病理基础。慢性支气管炎最初表现为间歇性咳嗽、咳痰，中医诊断为“咳嗽”；继之肺失宣降，久病肺虚伴喘，中医又诊断为“喘证”；慢性支气管炎反复迁延可并发肺动脉高压、肺源性心脏病，出现以心慌、水肿、口唇发绀等心衰表征时，属于中医的“肺胀”范畴。二陈汤由半夏、陈皮、茯苓、甘草组成。方中半夏燥湿化痰，主治脾湿痰壅之痰多咳喘气逆；陈皮燥湿化痰，理气健脾、和胃止呕；茯苓健脾渗湿，宁心安神；甘草补脾益气、润肺止咳。诸药合用共奏燥湿和中，理气化痰之功。

基于假复层纤毛柱状上皮-黏液共同构成纤毛-黏液排送系统。气道中吸入的粉尘、病原体可被黏液黏附，靠纤毛自下而上摆动，将黏液以痰的形式咳出体外，故黏液是净化气道的重要组成部分。慢性支气管炎患者表现咳嗽、咳痰，痰量多，而且黏稠，不易咳出。其机制是由于黏液分泌过多，纤毛因负荷过重而发生粘连、倒伏、甚至脱落。气道黏液中95%以上是水，其余为离子、蛋白和糖蛋白等〔14〕，黏液中的水与黏蛋白比例失衡，尤其黏液中的高黏蛋白含量增加，使痰液黏稠形成黏液栓，难以咳出，导致气流受限。AQP5是主要的水转运通道，黏液下腺AQP5的减少可以导致气道水分含量的减少和黏蛋白浓度增加〔15〕。本研究显示，AQP5表达降低引起的黏液中的水分泌下降。作为衡量气道上皮黏液分泌指标的MUCSAC在慢性支气管炎模型组表达增加，导致气道黏蛋白分泌增加，使痰变得黏稠不易咳出，从而继发感染，加重病情。Towne等〔16,17〕研究发现，用TNF-α干预培养小鼠肺上皮细胞后AQP5蛋白表达下降，肿瘤坏死因子(TNF)-α可以诱导大鼠气管上皮细胞MUCSAC蛋白的高表达。本文提示二陈汤可能通过上调AQP5表达的同时，下调黏蛋白MUCSAC的表达，影响气道黏液中水分与黏蛋白的比例，从而发挥其利痰清肺的作用。

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