葛根素对大鼠肝星状细胞生长及NF-κB p65和TGF-β1表达的影响

雷凯雄 周清平 唐武成 杨 莉

(南华大学附属第一医院感染科，湖南 衡阳 421001)

肝纤维化是多种慢性疾病发展为肝硬化的中间病理过程，是细胞外基质合成和降解失衡致使其过渡沉积的结果；肝星状细胞是细胞外基质的主要来源，该细胞的活化和增殖被认为是肝纤维化发生的关键因素〔1，2〕。肝纤维化是一种机体的慢性炎症反应，炎症过程在其发生发展过程中发挥重要作用〔3，4〕。肝星状细胞是肝脏炎症过程的靶细胞和效应细胞，它的活化过程受到多种信号通路和细胞因子的共同调控。核转录因子(NF)-κB是一种炎症反应最为重要的转录因子，在肝脏炎症反应活性氧、细胞因子和炎性因子等的产生和分泌过程中发挥重要的调控作用〔5〕。转化生长因子(TGF)-β1是介导纤维化最关键的细胞因子，在细胞外基质代谢和激活肝星状细胞方面发挥重要作用〔6，7〕。葛根素是一种在癌症、糖尿病和心血管疾病等多种疾病中具有很好抗感染作用的常用中药〔8〕。本研究旨在探讨葛根素对肝星状细胞生长及NF-κB p65、TGF-β1表达的影响。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂和仪器 大鼠肝星状HSC-T6 细胞购于上海美轩生物科技公司，葛根素购于南京狄尔格公司。RPMI1640培养基和二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，胰蛋白酶购于美国Hyclone公司，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)试剂和Trizol试剂购于美国Inbitrogen公司，青链霉素购于杭州吉诺公司，一抗(NF-κB p65抗体和β-actin抗体)购于美国Abcam公司，二抗 〔辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔〕购于武汉博士德公司，总蛋白提取试剂、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒、细胞周期检测试剂盒和电化学发光(ECL)检测试剂盒购于南京碧云天公司。电泳仪和转膜仪购于北京六一仪器厂，CO2培养箱购于美国Forma Scientific公司，酶标仪购于美国Bio-Tek公司。

1.2细胞处理 将复苏后的HSC-T6细胞种植于含有RPMI1640培养基的培养瓶中，其中培养基中加有10%胎牛血清和1%青链霉素。放置于5%CO237℃恒温细胞培养箱内培养，每2 d换液一次，观察细胞生长至铺满瓶底70%左右时，开始加0.25%胰蛋白酶消化传代。收集稳定生长的对数生长期HSC-T6 细胞进行实验。

1.3细胞增殖实验 将上述收集的HSC-T6细胞，以每孔100 μl细胞悬液(细胞浓度为4.5×106个/ml)接种至96孔细胞板中培养，1 d后更换培养基。将HSC-T6细胞随机分别溶剂组和葛根素组，其中，葛根素组包括0.1、1.0和10.0 μmol/L 3个不同浓度组，溶剂组中加入等量浓度为0.1% DMSO的培养基，每组设4个平行孔，重复3次，分别于培养箱内反应24、48和72 h。配制至所需时间后，加入20 μl MTT溶液，待反应4 h后，以酶标仪检测各组的吸光度OD值(检测波长为450 nm)。

1.4细胞周期实验 取6孔细胞板，以每孔100 μl细胞浓度为5.0×106个/ml的悬液进行接种，在常规条件5%CO2和37℃细胞培养箱中培养过夜。根据1.3中的分组处理细胞，培养72 h后，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤、离心后，收集细胞，加500 μl预冷的70%乙醇，在4℃环境下反应4 h，离心弃上清，加RNase A 100 μl常温反应30 min。再加碘化丙啶400 μl于4℃下避光反应30 min。于流式细胞仪上检测各组HSC-T6细胞的周期分布情况。每组实验均重复3次。

1.5酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞中TGF-β1的含量 取对数生长期的HSC-T6细胞，经胰酶消化后，按照每孔100 μl(细胞浓度同上)接种到96孔板中，与细胞培养箱中常规培养过夜后，以葛根素按1.3中的分组处理细胞，再培养72 h后，离心收取上清液，参照ELISA试剂盒说明书步骤检测各组HSC-T6细胞中TGF-β1的表达情况。

1.6Western印迹检测NF-κB p65蛋白的表达 将葛根素处理72 h后的HSC-T6细胞，以PBS洗涤后，加预冷的RIPA裂解液提取总蛋白，并以BCA法进行定量。取总蛋白样品60 μg和5倍上样缓冲液5 μl混合，置于沸水浴中变性10 min。在SDS-PAGE凝胶中上样变性蛋白，电泳结束后，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。以封闭液(含5%脱脂奶的粉TBST)作用2 h后，加NF-κB p65(1∶500稀释)和β-actin(1∶1 000稀释)一抗4℃下孵育24 h。TBST洗膜后，加1∶5 000倍稀释的HRP标记羊抗兔二抗，常温孵育2 h。洗膜后，加ECL显色定影。采用Band Scan软件分析条带，以β-actin作内参，计算各组HSC-T6细胞中NF-κB p65蛋白的相对表达量。

1.7统计学方法 运用SPSS21.0软件进行t检验、One-way ANOVA和LSD-t检验。

2 结 果

2.1葛根素对HSC-T6细胞增殖的影响 MTT分析显示，与溶剂组相比，不同浓度葛根素均能抑制HSC-T6细胞增殖(P<0.05)，且表现出一定的浓度-时间效应关系。在72 h时10.0 μmol/L葛根素处理下，HSC-T6 细胞OD值下降幅度最大。因此，选用72 h作用时间进行后续实验。见表1。

表1 各组HSC-T6 细胞的OD值

与溶剂组比较：1)P<0.05；下表同

2.2葛根素对HSC-T6 细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果显示，经葛根素处理后的HSC-T6 细胞的周期分布明显发生了改变，细胞被阻滞于G0/G1期。与溶剂组比较，葛根素处理组中细胞在G0/G1期所占比例明显升高(P<0.05)，而S期和G2/M期细胞比例明显降低(P<0.05)，且随葛根素浓度的增加，变化越显著。见表2。

表2 各组HSC-T6 细胞的周期分布

2.3葛根素对HSC-T6细胞中TGF-β1表达及NF-κB p65蛋白的影响 与溶剂组相比葛根素处理组中TGF-β1含量随葛根素浓度的增加而呈下降趋势，NF-κB p65蛋白的相对表达水平明显降低，且表现出一定的葛根素浓度效应关系(P<0.05)。见表3，图1。

表3 葛根素对各组HSC-T6 细胞中TGF-β1表达

图1 Western印迹检测NF-κB p65蛋白表达结果

3 讨 论

肝纤维化的发病机制是一个复杂的过程，肝星状细胞的异常增殖与活化是肝纤维化发生和形成的关键环节，因此抑制肝星状细胞的生长是治疗和改善肝纤维化的重要机制。葛根素是一种从中药葛根中提取的异黄酮类化合物，对多种细胞的生长过程具有很好的抑制作用。在低氧环境下，葛根素对缺氧导致的肺动脉平滑肌细胞增殖具有明显的抑制作用，进而对改善和治疗缺氧性肺动脉高压有良好的效果〔9〕；在血管平滑肌细胞中，葛根素通过上调p27蛋白和下调细胞周期蛋白(cyclin)E表达使G0/G1期细胞数增多，S期细胞数减少，进而抑制血管平滑肌细胞增殖〔10〕。本研究结果发现，葛根素能够呈浓度-时间依赖性抑制HSC-T6细胞增殖，与郝原青等〔11〕结果相吻合。本研究结果提示，葛根素具有很好的抗肝纤维化作用，其作用机制可能与诱导肝星状细胞周期阻滞有关。

葛根素具有抗肿瘤、抗氧化和抗感染等多种生理作用，而其抗感染作用正逐渐受到关注和重视；它能够通过调控炎性因子、免疫细胞和信号通路等多种方式发挥抗感染作用，从而改善癌症、心血管疾病和糖尿病等炎症相关疾病的病理过程〔8，12〕。潘亮亮等〔13〕指出，在Lewis肺癌荷瘤小鼠中，葛根素可能通过增加肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-2含量和抑制肿瘤组织基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达，抑制小鼠Lewis肺癌原发瘤的生长和转移。Liu等〔14〕研究发现，在脑缺血/再灌注大鼠模型中，葛根素能够降低缺血梗死体积，降低脑组织中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达，从而改善神经功能。Pan等〔15〕在葛根素减轻糖尿病大鼠肾损伤的机制研究中发现，其作用机制可能与葛根素下调TNF-α和细胞间黏附分子(ICAM)-1的水平有关。同时，胡丽梅等〔16〕还发现，在妊娠糖尿病患者中，葛根素能够抑制炎症信号通路TLR4/NF-κB的活化而减少炎性因子的释放。炎症反应与肝纤维化的发生发展密切相关〔17〕，肝细胞分泌的各种细胞因子、炎性因子和生长因子等是激活肝星状细胞的重要机制之一。NF-κB是介导炎症反应的关键调节因子，TGF-β1是最为强效的致纤维化细胞因子，在肝纤维化的发生发展过程中均发挥重要作用。Ji等〔18〕指出，葛根素能够通过调控NF-κB信号通路抑制动脉粥样硬化的炎症反应。Tao〔19〕发现，葛根素能够抑制心肌梗死小鼠单核细胞趋化蛋白(MCP)-1的活化，降低心肌组织中TGF-β1的表达，从而减轻小鼠的心肌纤维化。本研究结果提示，葛根素可能通过抑制炎症相关因子TGF-β1和NF-κB信号通路，缓解肝纤维化过程中的炎症反应，进而起到抑制HSC-T6细胞生长的作用。

综上，葛根素能够抑制肝星状细胞生长，其作用机制可能与抑制炎症相关因子TGF-β1和NF-κB信号通路有关。

1常 虹，郭 凯，孟洪宇，等.中药有效成分作用于肝星状细胞抗肝纤维化分子机制研究进展〔J〕.中国现代中药，2017；19(1)：148-53.

2Trautwein C，Friedman SL，Schuppan D，etal.Hepatic fibrosis：concept to treatment〔J〕.J Hepatol，2015；62(1)：S15-24.

3李楚天，何青莲，罗碧怡，等.慢性肝炎患者肝脏炎症程度与肝纤维化的关系〔J〕.广东医学，2014；35(17)：2713-4.

4Czaja AJ.Hepatic inflammation and progressive liver fibrosis in chronic liver disease〔J〕.World J Gastroenterol，2014；20(10)：2515-32.

5郭 隽，张立实，彭双清.NF-κB在MT对LPS致肝脏炎症损伤保护效应中的作用〔J〕.毒理学杂志，2014；28(5)：364-9.

6Meng X，Nikolic-Paterson DJ，Lan HY.TGF-β：the master regulator of fibrosis〔J〕.Nat Rev Nephrol，2016；12(6)：325-38.

7Borthwick LA，Wynn TA.IL-13 and TGF-β1：core mediators of fibrosis〔J〕.Curr Pathobiol Rep，2015；3(4)：273-82.

8张晓丹，王力维，王淑静，等.葛根素通过调控活性氧对缺氧诱导的PAMCs增殖的影响〔J〕.中国中药杂志，2018；34(1)：8-11.

9张晓月，王力维，王淑静，等.葛根素通过调控活性氧对缺氧诱导的PAMCs增殖的影响〔J〕.中国中药杂志，2015；40(15)：3027-33.

10沈晓君，魏 群，陈 芳，等.葛根素对血管平滑肌细胞周期相关蛋白表达的影响〔J〕.中国中医基础医学杂志，2011；17(1)：69-70.

11郝原青，郭晓雪，丁雅珊，等.葛根素对大鼠酒精性肝纤维化的干预作用以及对肝星状细胞增殖活化的影响〔J〕.天津中医药大学学报，2016；35(2)：132-5.

12Zhou YX，Zhang H，Peng C.Puerarin：a review of pharmacological effects〔J〕.Phytother Res，2014；28(7)：961-75.

13潘亮亮，白光振，强晓菲，等.葛根素对Lewis肺癌荷瘤小鼠的作用及机制〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(20)：5780-1.

14Liu X，Mei Z，Qian J，etal.Puerarin partly counteracts the inflammatory response after cerebral ischemia/reperfusion via activating the cholinergic antiinflammatory pathway〔J〕.Neural Regen Res，2013；8(34)：3203-15.

15Pan X，Wang J，Pu Y，etal.Effect of puerarin on expression of ICAM-1 and TNF-α in kidneys of diabetic rats〔J〕.Med Sci Monit，2015；21(64)：2134-40.

16胡丽梅，秦淑芬，姜保慧，等.葛根素联合门冬胰岛素对妊娠期糖尿病患者TLR4/NF-κB 炎症信号通路及脂肪因子的影响〔J〕.河北医药，2016；38(16)：2443-6.

17王修锋，吴永斌.慢性乙型肝炎中医体质类型与肝脏炎症分级及肝纤维化程度的关系研究——附92例临床资料〔J〕.江苏中医药，2016；48(5)：42-3.

18Ji L，Du Q，Li Y，etal.Puerarin inhibits the inflammatory response in atherosclerosis via modulation of the NF-κB pathway in a rabbit model〔J〕.Pharmacol Rep，2016；68(5)：1054-9.

19Tao Z.Puerarin inhibits cardiac fibrosis via monocyte chemoattractant protein(MCP)-1 and the transforming growth factor-β1(TGF-β1) pathway in myocardial infarction mice〔J〕.Am J Transl Res，2016；8(10)：4425-33.