N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断对癫痫模型大鼠行为学、脑电图及脑内泛连接蛋白-1表达的影响

罗海龙 姜爱英 贾 茜 郭艳芹 毕鹏翔 张忠敏 董 妍

(牡丹江医学院附属红旗医院神经内科，黑龙江 牡丹江 157000)

癫痫是以神经元过度放电所导致的突然反复发作和暂时性中枢神经系统功能失常为特征的慢性神经系统常见病〔1〕。癫痫发病率与性别和年龄的关系较为密切，一般来讲，女性患病率高于男性，1 岁内患病率高，随着年龄逐渐增高，而患病率呈逐渐下降趋势，在老年人群患病率较低〔2〕。如长期反复发作或是癫痫持续状态，可引起患者语言、记忆甚至学习等认知功能障碍及导致海马和(或)颞叶神经出现异常，但是目前关于癫痫的具体发病机制尚未完全阐明〔3,4〕。研究发现，导致癫痫发作的一个重要原因为N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体过度激活〔5,6〕。NMDA受体阻断具有明显的神经元保护作用，并抑制神经元泛连接蛋白(Panx)-1表达〔7〕。本研究旨在研究NMDA受体阻断对癫痫大鼠行为学、脑电图及海马和颞叶Panx-1表达的影响。

1 资料与方法

1.1实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠70只，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供(通过牡丹江医学院动物实验伦理委员批准)，实验动物合格证号为：P00102008，生产许可证号：SCXK(黑)2015-001，使用许可证号：SYXK(黑)2015-007。空调恒温室内22℃，相对湿度50%，自由饮食，通风换气20次/h，适应性饲养1 w。

1.2实验药物及主要试剂 NMDA受体拮抗剂MK-801(地卓西平，纯度>98.0%)购于美国Apexbio公司；Panx-1抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国Sigma公司；增强化学发光(ECL)试剂盒(美国Amersham Bioscience公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；二辛可宁酸(BCA)蛋白定量试剂盒购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3主要仪器 动物立体定向仪(ALC-H，北京吉安得尔科技有限公司)；多道生理信号采集处理系统购自(RM6240型，成都仪器厂)；蛋白成像系统(ChemiDoc XRS，美国BIO-RAD公司)；转膜仪(VE-186，上海天能科技有限公司)；电泳仪(PowerPac HV，美国BIO-RAD公司)。

1.4大鼠癫痫模型复制 SD大鼠60只术前禁食12 h，不禁水。称重后，腹腔注射10% 水合氯醛(4 ml/kg)麻醉后，仰卧位固定于脑立体定位仪上，剪毛，络合碘消毒皮肤，沿大鼠头部正中线作1 cm 的纵向切口，暴露前囟和冠状缝。以微量注射器于大鼠右侧海马CA3中心区(前囟后3.8 mm，中线旁4.9 mm，颅骨下7.0 mm)处在10 min内缓慢注射海人酸(0.5 μg/μl)2 μl，术后缝合头皮，肌注青霉素以预防感染〔8〕。正常对照组(n=10)以生理盐水代替海人酸注射，余操作与以上相同。

1.5模型复制成功标准 癫痫发作症状拟采用Racine分级标准：0级：无任何反应；Ⅰ级：面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等；Ⅱ级：Ⅰ级加节律性点头；Ⅲ级：Ⅱ级加前肢肌阵挛，但无后肢直立位；Ⅳ级：Ⅲ级加后肢直立位；Ⅴ级：全面性强直-阵挛发作，并失去体位控制〔9〕。达到Ⅳ级为癫痫模型复制成功。制备模型过程中，如果出现大鼠死亡现象，或者Racine分级未达到Ⅳ级，则按照随机原则补齐大鼠。

1.6分组及给药 大鼠癫痫模型复制过程中6只死亡，14只因Racine分级未达到Ⅳ级而弃用。剩余符合条件的40只大鼠按照随机数字表法分为模型组，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg组，每组10只。模型复制成功后，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg组腹腔注射相应剂量的MK-801〔10，11〕，正常对照组和模型组腹腔注射等量的生理盐水，1次/d，连续21 d。

1.7行为学观察 ①按照Racine分级标准，记录各级别的发作数量。②给药过程中记录治疗平均癫痫发作时间，平均癫痫发作时间=发作总时间/发作总次。

1.8脑电图检测 RM6240型多道生理信号采集处理系统记录各组大鼠脑电图波形，并分析脑电图波形的频率及波幅。

1.9取材 行为学观察及脑电图检测后，各组大鼠断头取脑，冰上分离海马及颞叶，-80℃保存，备用。

1.10蛋白质Western印迹法检测海马和颞叶Panx-1表达 严格按照试剂盒说明书提取海马和颞叶总蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测定总蛋白浓度。取50 μg蛋白上样后进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电泳完毕后， 湿转移法转膜至0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封闭液〔5% 脱脂奶粉封闭+吐温磷酸盐缓冲液(PBST)〕封闭2 h。 然后与Panx-1抗体(1∶500稀释)4℃孵育过夜，反复吐温 Tris-缓冲盐溶液(TBST)漂洗3次，与辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000稀释)孵育2 h。ECL试剂反应，X线(暗室)曝光，室温显影，定影。ChemiDoc XRS蛋白成像系统对各组条带进行灰度值计值。以GAPDH抗体(1∶2 000稀释)为内参。

1.11实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)检测神经元Panx-1 mRNA的表达 Trizol试剂提取总RNA，检测RNA纯度，按照Real Time-PCR试剂盒进行反转录反应，合成单链的cDNA。cDNA产物保存在-20℃。利用Pubmed查找相关基因序列，并利用引物合成软件Primer Premier 5.0设计引物。Real Time-PCR反应体系：体积为20 μl；反应程序为：95℃预变性10 s，50℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40个循环，最后72℃ 延伸5 min。每个样本以内参基因GAPDH调整。2-ΔΔCT法定量分析。引物序列Panx-1：正义TCTGCTCCGACCTGAA，反义GAAGAGCGTGTAGATGACC，168 bp；GAPDH：正义GAGGGAAATCGTGCGTGAC，反义GCATCGGAACCGCTCATT，212 bp。

1.12统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件进行单因素方差分析、LDS、Games-Howell检验和秩和检验。

2 结 果

2.1各组Racine分级结果 与正常对照组比较，模型组Racine分级级别显著升高(P<0.01)；与模型组比较，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg组Racine分级级别显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 各组Racine分级结果比较(n,n=10)

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；表2同

2.2各组平均癫痫发作时间 与正常对照组比较，模型组平均癫痫发作时间显著延长(P<0.01)；与模型组比较，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg组平均癫痫发作时间显著缩短(P<0.05，P<0.01)。见表2。

2.3各组脑电图检测结果 与正常对照组比较，模型组脑电频率显著降低，脑电波幅显著升高(P<0.01)；与模型组比较，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg组脑电频率显著升高，脑电波幅显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表2。

2.4各组海马和颞叶Panx-1蛋白、mRNA表达 与正常对照组比较，模型组海马和颞叶Panx-1蛋白、mRNA表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，MK-801 0.5、1.0、1.5 mg/kg组海马和颞叶Panx-1蛋白、mRNA表达显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表2，图1。

表2 各组癫痫发作时间、脑电图检测及Panx-1蛋白、mRN相对表达量比较

A.正常对照组；B.模型组；C.MK-801 0.5 mg/kg组；D.MK-801 1.0 mg/kg组；E.MK-801 1.5 mg/kg组图1 各组Panx-1表达Western印迹结果

3 讨 论

NMDA 受体主要存在于大脑的神经细胞上，是一种跨膜离子通道型谷氨酸受体，在调节大脑学习和认知功能及可塑性等发面具有十分重要的作用，其功能发生障碍所导致的兴奋性神经毒性则与智力障碍、精神分裂症、自闭症、癫痫等众多神经系统疾病相关〔12,13〕。癫痫发生与NMDA受体过度激活有关，其在癫痫发生过程中发挥的作用正受到越来越多的关注〔14,15〕。在全脑几乎都有NMDA受体分布，分布最多的位置主要包括大脑皮质、纹状体、杏仁体、颞叶、海马等〔16〕。NMDA受体是神经元中一种重要的配体依赖的电压门控的选择性钙离子通道，具有电压依赖性的Mg2+阻断特性及对钙离子的高通透性，当NMDA受体过度激活，解除了内源性Mg2+的阻滞作用，过多的神经元的突触后膜发生同步性去极化，发生持续性放电，最后引起癫痫〔17〕。目前有关于NMDA受体的研究主要集中于药物对其表达的影响〔18,19〕。关于NMDA受体阻断对癫痫模型大鼠行为学、脑电图的影响鲜见报道。本研究提示NMDA受体阻断对改善癫痫大鼠癫痫行为及脑内神经元异常放电产生积极影响。

Panx-1蛋白是缝隙连接半通道蛋白，其主要功能可能是介导神经细胞之间异常同步放电，与NMDA受体密切相关，可以被NMDA受体激活进而引起癫痫〔20〕。本研究结果提示，NMDA受体阻断可明显降低癫痫大鼠海马和颞叶Panx-1和Panx-1 mRNA表达。

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7罗海龙，贾 茜，姜爱英，等.N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断对大鼠海马神经元癫痫样放电模型泛连接蛋白-1表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2017;37(23)：5752-5.

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