miRNAs对白内障患者晶状体上皮细胞中氧化损伤的生物学效应及其机制

邹 莹

(白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000)

白内障的发生机制与年龄、氧化作用、外伤等多种因素有关，其中年龄相关性白内障发病机制包括氧化应激、细胞凋亡、钙蛋白酶激活等。相关研究发现，miRNA在人晶状体上皮细胞(LECs)的凋亡过程中发挥不同程度的调控作用，如miR-125通过抑制靶基因p53的表达来抑制LECs的凋亡〔1〕。miR-204表达于LECs中，通过Meis-2调控PAX6的转录，影响晶状体分化〔2〕。目前关于miR-204在年龄相关性白内障发病过程中与氧化损伤的关系及作用机制的研究鲜有报道，我们通过前期实验，用生物信息学预测分析软件RASMOL、ICMLite、CrystInfo共同预测了TP53INP1是miR-204的靶基因之一，同时使用Active Motif 双荧光素酶报告基因验证了该结果。本研究拟探讨miR-204对年龄相关性白内障氧化损伤的抑制作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 2015年10月至2016年3月在本院行白内障手术的30例皮质性年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜标本；取同期本院眼库收集的30例正常供体眼球晶状体前囊膜标本。本次研究经本院伦理委员会批准，患者均自愿参与并签署知情同意书。主要试剂：HLE-B3 LECs(广州吉赛生物科技有限公司)；DMEM细胞培养基、胎牛血清(上海哈灵生物科技有限公司)；兔抗人TP53INP1一抗、p53一抗(上海博耀生物科技有限公司)；HRP标记的羊抗兔二抗(上海科兴生化试剂有限公司)；ECL发光试剂盒、RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(上海静融生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR检测 将收集到的标本放于裂解液中裂解，使用RNA提取试剂盒获取囊膜中的总RNA，用分光光度法检测提取RNA的纯度。收集1 μl Oligo(dT)和7 μl总RNA，按M-MLV步骤逆转录得到cDNA。加入Mix 4.0 μl、miR-204 0.3 μl、GAPDH 0.3 μl、上下游引物各0.3 μl。去RNA酶水4.4 μl和cDNA 1.0 μl建立反应体系。常规扩增条件，共40个循环，计算目的基因的相对表达量。

1.2.2细胞培养及转染 HLE-B3细胞复苏后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，放于37℃，5% CO2浓度的细胞培养箱中，取对数生长期细胞以1×105/孔加入到6孔板中。取1 nmol miR-204拟似物、拮抗物和对照RNA转染试剂溶于50 μl无菌蒸馏水中分装。细胞生长到40%～50%融合时，分为正常对照组和miR-204拟似物组、miR-204拮抗物组、拟似物对照组、拮抗物对照组。对照组不加转染试剂，另外4组将稀释的转染试剂加入相应培养孔中，终浓度分别为10、50、100、150 nmol/L，继续培养1 d，用实时荧光定量PCR检测细胞中miR-204表达量进而验证转染效率。

1.2.3细胞模型建立与分组 取对数期HLE-B3细胞，以1×105/孔加入到6孔板中，生长至80%融合时，每孔加入3% 过氧化氢，终浓度200 μmol/L处理6 h，建立体外LECs氧化损伤模型，并分为模型对照组、miR-204拟似物组、miR-204拮抗物组、拟似物对照组、拮抗物对照组，过氧化氢(未经H2O2)处理的细胞为正常对照组。H2O2作用6 h后，弃去上清，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，换DMEM培养液，孵育12 h。

1.2.4细胞凋亡检测 经H2O2处理后的各组转染细胞中加入胰酶消化为单细胞悬液，每组细胞数约1×105个，2 000 r/min离心10 min，弃去培养液。PBS冲洗2次，避光染色30 min，置于流式细胞仪中检测细胞凋亡情况，波长488 nm，绘制流式细胞仪图，计算细胞凋亡率。

1.2.5细胞中TP53INP1 mRNA和p53 mRNA表达量检测 使用RNA提取试剂盒抽提总mRNA，紫外分光光度法检测纯度。cDNA合成试剂盒mRNA逆转录为cDNA，特异性引物行实时荧光定量PCR检测TP53INP1 mRNA、p53mRNA的表达量，以GAPDH为内参。常规反应条件下共45个循环，计算目的基因的相对表达量。

1.2.6细胞中TP53INP1 mRNA和p53蛋白表达检测 采用Western印迹法进行检测，各组细胞中加入100 μl细胞裂解液后提取总蛋白，BCA法测定浓度。取10 μg蛋白行聚丙酰胺凝胶电泳，将目标蛋白转至NC膜，室温下5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗(1∶5 000稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗膜，加二抗(1∶5 000稀释)，室温下孵育1 h，TBST洗膜，ECL发光液显影5 min，暗室曝光、洗片。以GAPDH为内参，计算目标蛋白灰度值。

1.3统计学分析 使用SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1miR-204 mRNA在年龄相关性白内障晶状体组织中的表达 白内障患者miR-204 mRNA表达量(0.57±0.05)明显低于正常人(1.38±0.06，P<0.05)。

2.2细胞转染后miR-204 mRNA的表达情况 正常对照组、miR-204拟似物组、miR-204拮抗物组、拟似物对照组、拮抗物对照组细胞中miR-204 mRNA表达量分别为1.10±0.01、5.32±0.47、0.56±0.08、0.96±0.45、1.47±0.29，其中miR-204拟似物组明显高于拟似物对照组(P<0.01)，miR-204拮抗物组明显低于拮抗物对照组(均P<0.01)。

2.3LECs凋亡情况 正常对照组、模型对照组、miR-204拟似物组、拟似物对照组、miR-204拮抗物组、拮抗物对照组LECs凋亡率〔(1.29±0.11)%、(4.85±0.37)%、(2.55±0.13)%、(4.30±0.19)%、(5.72±0.22)%、(4.25±0.53)%〕差异均有统计学意义(P<0.05)，模型对照组明显高于正常对照组，miR-204拟似物组明显低于拟似物对照组；miR-204拮抗物组明显明显高于拮抗物对照组(P<0.05)，但拟似物对照组和拮抗物对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4各组LECs中TP53INP1和p53 mRNA及蛋白表达情况 各组间TP53INP1和p53 mRNA及蛋白的表达量差异均有统计学意义(P<0.05)，其中模型对照组明显高于正常对照组(P<0.01)；miR-204拟似物组明显低于拟似物对照组，miR-204拮抗物组明显高于拮抗物对照组(P<0.05)。见图1、表1。

1正常对照组；2 模型对照组；3 miR-204拟似物组；4 拟似物对照组；5 miR-204拮抗物组；6 拮抗物对照组图1 各组LECs中TP53INP1和p53蛋白表达电泳图

组别目的基因TP53INP1p53目的蛋白TP53INP1p53正常对照组079±021076±020100±000100±000模型对照组142±0131)246±0251)160±0171)286±1221)miR⁃204拟似物组073±0022)063±0232)077±0052)139±0202)拟似物对照组135±006219±019143±025262±026miR⁃204拮抗物组170±0283)330±0283)185±0033)280±0023)拮抗物对照组125±019261±053130±022251±005

与正常对照组比较:1)P<0.05；与拟似物对照组比较:2)P<0.05；与拮抗物对照组比较:3)P<0.05

3 讨 论

白内障发生机制中氧自由基损伤发挥重要作用，晶状体氧化损伤的可能机制为细胞凋亡的信号通路被氧自由基激活，生物膜受损，钙泵功能障碍，导致胞内钙离子平衡被破坏，引发细胞凋亡。白内障患者房水中H2O2浓度明显高于正常人，而H2O2在体外可诱导细胞凋亡，常被用于氧化损伤模型的建立。

miRNA作为内源性非编码RNA分子，参与细胞增殖、凋亡等过程，与多种疾病之间存在相关性。miRNA可参与白内障的发生与发展，但miR-204与白内障损伤发生机制的关系仍未明确。相关研究显示，miR-204参与晶状体分化及视盘发育的调控，可能通过作用于MEIS-2基因来调控PAX6基因转录，影响晶状体分化〔3〕。本研究说明与年龄相关性白内障发生存在关联。miR-204拟似物可上调miR-204表达水平；miR-204拮抗物可下调miR-204表达水平。人LECs转染miR-204拟似物后胞内miR-204表达水平上调，而转染miR-204拮抗物的结果正好相反；提示miR-204参与了LECs氧化损伤过程中的细胞凋亡，相关研究显示，miR-125b能够抑制基因p35表达，调控LECs凋亡，本次研究中miR-204与TP53INP1表达水平相反，说明miR-204可负向调节TP53INP1靶基因，进而参与LECs氧化损伤过程，推测miR-204表达上调对LECs凋亡抑制作用的机制可能通过部分生物信号发挥作用。

TP53INP1在p53诱导细胞凋亡中起重要作用，当细胞处在应激极化状态时该转录因子表达上调。TP53INP1是多种miRNAs的靶基因，如在乳腺癌发病过程中miR-125b调控TP53INP1的表达起重要作用〔4〕；在白血病发病过程中，miR-93调控TP53INP1发挥关键作用〔5〕。本研究证实了TP53INP1是miR-204的靶基因；在H2O2处理的LECs中TP53INP1 mRNA和蛋白表达明显高于正常LECs，进一步证实了细胞应激状态下TP53INP1表达上调的现象。p53是细胞凋亡的重要调控基因，可参与调控整个细胞周期，加速DNA修复和细胞应激反应后的衰老过程〔6〕。本研究说明氧化损伤细胞中p53被激活，进而激活靶基因TP53INP1，通过调控细胞凋亡参与年龄相关性白内障的发生。

1Ang M,Fenwick E,Wong TY,etal.Utility of EQ-5D to assess patients undergoing cataract surgery〔J〕.Optom Vision Sci,2013;90(8):861-6.

2Park S,Kim T,Cho SI,etal.Association between cataract and the degree of obesity〔J〕.Optom Vision Sci,2013;90(9):1019-27.

3Guan H,Mick A,Porco T,etal.Preoperative factors associated with IOP reduction after cataract surgery〔J〕.Optom Vision Sci,2013;90(2):179-84.

4Wongsompipatana P,Ikeda M,Katemake P,etal.Equivalent lightness of elderlies investigated by cataract experiencing goggles〔J〕.Color Res Appl,2013;38(4):267-76.

5Machan CM,Hrynchak PK,Irving EL,etal.Age-related cataract is associated with type 2 diabetes and statin use〔J〕.Optom Vision Sci,2012;89(8):1165-71.

6Machan CM,Hrynchak PK,Irving EL,etal.Modeling the prevalence of age-related cataract:Waterloo eye study〔J〕.Optom Vision Sci,2012;89(2):130-6.