尿石素B对地塞米松诱导小鼠肌萎缩的改善作用及机制

王丛丛 李 军 鲁飞翔 吕裕霞 刘庆春

(锦州医科大学武警总医院联合培养基地，北京 100039)

肌肉减少综合征(简称肌少症)是一种随着年龄增加，表现出的以肌肉质量、力量和功能减退的一种身体状态〔1〕，直至2016年被正式纳入到ICD-10疾病编码中，标志着医界正式将其视作一种有独特特征的疾病。一项在中国社区老人中的调查显示，按照亚洲诊断标准，60岁以上的男、女性肌少症患病率分别为8.2%、12.5%〔2〕，而肌少症是一系列不良结果的独立危险因素，如影响生活质量，增加跌倒风险，住院天数延长或对多种疾病的预后有不良影响。目前，肌少症主要有效的预防措施是增加优质蛋白质的摄入(1.0～1.2 g·kg-1·d-1)和加强运动，尚无有效的药物治疗措施〔3〕。有研究表明，经常摄入富含鞣酸和鞣花单宁的浆果及坚果对人体健康大有裨益，有抗肿瘤、抗菌抗炎、心血管代谢、抗氧化、保护神经等作用，但是鞣酸本身不易被小肠吸收，很难发挥作用〔4〕。Seeram等〔5〕发现鞣酸单宁在肠道的代谢产物尿石素A、B普遍存在于体液中，且进食富含鞣酸单宁的食物可以缓解应激期的肌肉损害〔6〕及高脂膳食对肌肉质量的影响〔7〕。因此尿石素可能对肌少症有潜在的治疗作用。本文通过地塞米松诱导的肌少症模型来研究尿石素对肌少症的作用，并探讨可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、药物与试剂及仪器 昆明鼠，雄性，32只，SPF级，5～6周龄，体重28.70～34.32 g，购于军事医学科学院，合格证号：SCXK-(军)2012-0004。饲养条件：室温(21.5±2.0)℃，相对湿度(50±5)%，12/12 h照明节律，自由进食、饮水。地塞米松(国药集团荣生制药有限公司，国药准字H41020036)购自武警总医院，尿石素B购于上海诗丹德有限公司，组织RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒购于艾德莱有限公司，PCR引物由上海生工有限公司合成。FA1004型电子天平，Echo MRITM小动物体成分分析仪，YLS-13A大小鼠抓力仪，英国Picdrop公司超微量分光光度计，DYY-6D型电泳仪，美国ABI2720型PCR仪，德国QIAGEN Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪。

1.2动物分组及给药 适应性喂养7 d后，采用系统随机抽样法将小鼠分组：①正常组；②模型组，每组16只动物，模型组按照10 mg·kg-1·d-1地塞米松注射液皮下注射，正常组16只给予对应体重的生理盐皮下注射。待确定模型成功后，各组内分为两个亚组，分别给予灌胃生理盐水和50 mg·kg-1·d-1尿石素B。共有正常组，正常给药组，模型组，模型给药组。

1.3小鼠体重及体成分测定 小鼠每天测体重，按体重给药。1 w进行1次体成分测试。即准确称量体重后，直接把未麻醉的小鼠放置在一定大小的透明塑料动物舱内，然后将动物舱插入Echo MRITM 侧面的管状空间，通过仪器专用的控制和分析软件进行扫描，测量得到小鼠的瘦体重、脂肪、自由水和总水含量。其中测量得到的瘦体重含量能直接反映小鼠的整体肌肉量。

1.4小鼠抓力测定 使用YLS-13A大小鼠抓力仪，测试前让小鼠在抓力仪上适应10 min，然后抓住小鼠尾巴，确定小鼠抓牢后，平稳的向后拉，记录仪器上抓力读书。测定三次并记录结果，用最大抓力作为反映肌肉力量的指标。

1.5小鼠腓肠肌苏木素-伊红(HE) 造模结束后，处死小鼠，分离小鼠两侧腓肠肌。左侧腓肠肌浸入4%多聚甲醛中固定，用于制作石蜡切片。HE染色后，采用LEICA图像采集系统选取4个视野进行拍片，放大倍数为200倍。每个视野选取10个肌纤维，应用Image J软件计算出每个肌纤维的横截面积。

1.6RT-PCR检测MyoD、MyoG、MuRF-1、Atrogin mRNA表达 取右下肢腓肠肌组织放入无菌Eppendorf管中，加液氮研磨。按照RNA提取试剂盒说明，进行组织RNA的提取。并对提取RNA浓度及纯度进行测定，并在反转录过程中将RNA的浓度调整一致，达到1 000 ng。按照TUREscript 1st Strand cDNA Synthsis Kit、2×SYBR Green qPCR Mix说明书进行RT-PCR。以GAPDH作为内参基因，正常组基因表达量作为标准，运用2-△△Ct法，计算各组中基因的相对表达水平。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、LSD及DunnettT3法检验。

2 结 果

2.1各组小鼠体重及体成分比较 造模结束时，模型给药组死亡2例，其余均正常。正常组与正常给药组小鼠稳定体重增加。与正常组比较，模型组及模型给药组体重明显下降，脂肪比重明显增加，筋肉比重明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组与模型组给药组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 小鼠体重及体成分改变

与正常组比较：1)P<0.05

2.2各组小鼠最大抓力比较 与正常组、正常给药组最大抓力〔(395.8±78.0)g、(351.0±33.3)g〕相比，模型组与模型给药组最大抓力均明显下降，分别为(257.0±27.3)g、(280.4±40.6)g，差异有统计学意义(P<0.05)。正常组、正常给药组两组与模型组、模型给药两组之间差异有统计学意义(F=12.809，P=0.000)，但两组内差异无统计学意义(P>0.05)。虽然模型给药组与模型组最大抓力差异无统计学意义(P=0.772)，但给药后最大抓力有增加的趋势。

2.3各组腓肠肌横截面面积比较 与正常组肌肉的横截面积〔(537.77±56.08)μm2〕相比，正常给药组面积稍下降〔(507.82±45.03)μm2〕，但两组之间差异无统计学意义(P=0.259)。模型组〔(283.39±34.12)μm2〕较正常组显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，模型给药组肌纤维横截面积则有所上升，为(396.50±40.97)μm2，模型组与模型给药组之间差异有统计学意义(P<0.05)，但模型给药组与正常组和正常给药组间差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 各组小鼠腓肠肌肌纤维横截面积(HE，×200)

2.4肌肉中相关基因mRNA比较 与正常组MyoD、MyoG mRNA表达水平比较，正常给药组MyoD、MyoG mRNA表达水平分别是正常组1.26，1.24倍，组内差异有统计学意义(P<0.05)；模型组与模型给药组则表现出明显降低，模型组MyoD、MyoG表达水平分别为正常组的0.35、0.24倍，差异有统计学意义(P<0.05)，模型给药组分别是正常组的0.60、0.87倍，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组MuRF-1与Atrogin mRNA表达水平是正常组的17.66、11.01倍，模型给药组MuRF-1、Atrogin mRNA则是正常组的4.23、4.05倍，表达水平较模型组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

肌少症是增龄相关性疾病，随着年龄的增长发病率也是逐渐增加的〔8〕。增龄不仅会引起骨骼肌质量的改变，同时也会使激素水平改变、能量蛋白质摄入减少、消化吸收功能下降、营养代谢水平下降、神经-肌肉功能衰退及线粒体、染色体损伤、炎性因子与自由基氧化损伤、细胞凋亡等的改变，这些均可能是影响肌少症发生的因素〔9〕。其中，增龄性的糖皮质激素水平异常升高与骨骼肌萎缩呈正相关，且增龄性的肌少症与地塞米松诱导的肌少症在一定程度上都呈现肌肉质量减少，肌力下降，肌纤维蛋白合成减少、分解加快的状态，且使肌纤维失去再生能力，两者的状态相似〔10〕。研究显示，糖皮质激素增加蛋白质的降解，主要是通过降低PI3K/Akt信号通路中一些基因的表达，如MyoG、MyoD，减少蛋白质的合成，同时激活泛素-蛋白酶体通路(UPS)和溶酶体自噬系统〔11〕，UPS系统中的泛素活性增加和泛素连接酶水平上升，使蛋白质降解增强，从而造成肌肉萎缩的，其中MuRF-1和Atrogin是UPS通路中的关键因素。

尿石素B主要是石榴、葡萄浆果类与坚果如核桃等的代谢产物鞣酸、鞣花单宁在肠道菌群的作用下，产生的系列产物中的一种，包括有尿石素A、B、C、D等，尿石素B是最终产物〔12〕。但由于人体肠道菌群的差异，体内尿石素的含量也存在很大的差异〔13〕。有动物实验显示，尿石素对健康是有益处的，不仅有抗炎的作用〔14〕，也能够维持和提高线粒体及肌肉的功能的作用〔15〕。直接补充尿石素可能是将其作用发挥到最大的一种有效措施。Mena等〔16〕在模拟人体消化系统对尿石素进行研究，表明经口摄入尿石素可以稳定发挥作用。另外，Heilman等〔17〕对尿石素A进行了安全性评估，在急慢性毒理试验中，均表明按照体重的5%在食物中添加尿石素不会对人体产生危害，这也为我们的试验提供了依据。

本实验采用鲁飞翔等〔18〕方法并进行改进，建立地塞米松诱导的小鼠肌少症模型，研究灌胃给予尿石素B对于地塞米松诱导的小鼠肌萎缩模型的影响。与以往研究结果一致〔19〕，本研究结果显示尿石素B能够改善地塞米松诱导的小鼠肌萎缩模型，有增加肌肉质量和力量的趋势，其机制主要是通过抑制泛素蛋白酶通路中的MuRF-1和Atrogin的表达，减轻肌蛋白的降解，同时上调 PI3K/Akt信号通路中MyoD和MyoG的表达水平，增加肌蛋白合成速率。

1Cruzjentoft AJ,Baeyens JP,Bauer JM,etal.Sarcopenia:European consensus on definition and diagnosis.Report of the European Working Group on Sarcopenia in Older People〔J〕.Age Ageing,2010;39(4):412-23.

2Hui W,Shan H,Li C,etal.Estimation of prevalence of sarcopenia by using a new bioelectrical impedance analysis in Chinese community-dwelling elderly people〔J〕.BMC Geriatrics,2016;16(1):216.

3Naseeb MA,Volpe SL.Protein and exercise in the prevention of sarcopenia and aging〔J〕.Nutr Res,2017;40:1.

4Garciamuoz C,Vaillant F.Metabolic fate of ellagitannins:implications for health,and research perspectives for innovative functional foods〔J〕.Crit Rev Food Sci Nutr,2014;54(12):1584-98.

5Seeram NP,Henning SM,Zhang Y,etal.Pomegranate juice ellagitannin metabolites are present in human plasma and some persist in urine for up to 48 hours〔J〕.J Nutr,2006;136(10):2481.

6Trombold JR,Barnes JN,Critchley L,etal.Ellagitannin consumption improves strength recovery 2-3 d after eccentric exercise〔J〕.Med Sci Sports Exer,2010;42(3):493.

7Rodriguez J,Gilson H.Pomegranate and green tea extracts protect against ER stress induced by a high-fat diet in skeletal muscle of mice〔J〕.Eur J Nutr,2015;54(3):377-89.

8程 群,郑丽丽,章振林.肌少症流行病学及发病机制〔J〕.中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2016;9(3):228-35.

9Harman D.The aging process〔J〕.Proceed Nat Acad Sci U S A,1981;78(11):7124.

10Kaasik P,Umnova M,Pehme A,etal.Ageing and dexamethasone associated sarcopenia:peculiarities of regeneration〔J〕.J Steroid Biochem Molec Biol,2007;105(1-5):85-90.

11Bodine SC,Furlow JD.Glucocorticoids and skeletal muscle〔J〕.Adv Exp Med Biol,2015;872:145.

12Selma MV,Beltrán D,García-Villalba R,etal.Description of urolithin production capacity from ellagic acid of two human intestinal Gordonibacter species〔J〕.Food Func,2014;5(8):1779.

13Pfundstein B,Haubner R,Würtele G,etal.Pilot Walnut intervention study of urolithin bioavailability in human volunteers〔J〕.J Agri Food Chem,2014;62(42):10264-73.

14Tomásbarberán FA,Garcíavillalba R,Gonzálezsarrías A,etal.Ellagic acid metabolism by human gut microbiota:consistent observation of three urolithin phenotypes in intervention trials,independent of food source,age,and health status〔J〕.J Agri Food Chem,2014;62(28):6535.

15Ryu D,Mouchiroud L,Andreux PA,etal.Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C.elegans and increases muscle function in rodents〔J〕.Nature Med,2016;22(8):879.

16Mena P,Dall'Asta M,Calani L,etal.Gastrointestinal stability of urolithins:an in vitro approach.〔J〕.Eur J Nutr,2017;56(1):99.

17Heilman J,Andreux P,Tran N,etal.Safety assessment of Urolithin A,a metabolite produced by the human gut microbiota upon dietary intake of plant derived ellagitannins and ellagic acid〔J〕.Food Chem Toxicol,2017;108:289-97.

18鲁飞翔,李 军,周仙杰,等.地塞米松致小鼠肌肉衰减综合征模型建立〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(22):5542-4.

19Rodriguez J,Pierre N,Naslain D,etal.Urolithin B,a newly identified regulator of skeletal muscle mass〔J〕.J Cachexia Sarcopenia Muscle,2017;8(4)：567-82.