miR-126对人晶状体上皮细胞凋亡的影响

汪 静

(武汉市艾格眼科医院，湖北 武汉 430000)

随着我国人口老龄化加剧，年龄相关性白内障发病率明显提升〔1〕，但其发病机制仍未明确。目前研究认为，晶状体上皮细胞凋亡是白内障发病的始动环节和病理生理改变基础〔2〕。miRNA是一类内源性具有调控作用的非编码RNA，可通过介导靶基因表达来发挥作用。相关研究已发现多种miRNA通过对人晶状体上皮细胞凋亡发挥调控作用，影响白内障进程〔3〕。动物实验表明，miR-126参与调控大鼠继发性白内障的发病过程〔4〕，但对人白内障形成的影响和作用机制仍未明确。锌指蛋白kruppel样因子(KLF)6基因可参与哺乳动物体内细胞凋亡、衰老等生理过程的调节，缓解多种年龄相关性疾病进展〔5〕。相关研究显示，在人晶状体上皮细胞氧化损伤状态下，上调KLF6表达水平可有效抑制细胞凋亡〔6〕，可见KLF6能够抑制白内障病情发展。本次研究使用miR-126模拟物、抑制物转染人晶状体上皮细胞系HLEB3，分析miR-126对HLEB3凋亡的影响并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人晶状体上皮细胞系HLEB3购于上海晶都生物技术有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购于北京雅安达生物技术有限公司；脂质体2000购于上海依赫生物科技有限公司；Trizol试剂盒、SYBR®Green Kit试剂盒购于宝日医生物技术有限公司；兔抗人KLF6多克隆抗体、小鼠免疫球蛋白(Ig)G二抗购于北京安必奇生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与转染 HLEB3培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，放入37℃ 5%CO2孵箱中培养，取对数生长期的HLEB3接种到6孔板，调整细胞浓度至40%～60%并进行转染。使用脂质体2000分别将100 nmol/L的miR-126 mimic(模拟物组)、miR-126 mimic Control(模拟物阴性对照组)、miR-126 inhibitor(抑制物组)、miR-126 inhibitor Control(抑制物阴性对照组)转染到HLEB3中，向每个培养孔中加入不含胎牛血清的DMEM培养基至终浓度体积为2 ml，转染48 h后收集各组细胞。

1.2.2氧化凋亡模型构建 向不含胎牛血清的DMEM培养基中加入3%H2O2配制成终浓度为0.3 mmol/L的H2O2DMEM培养基，分别加入到转染后的各组HLEB3中，同时设置凋亡模型组(使用未转染的HLEB3构建凋亡模型)和正常HLEB3组(用含10%胎牛血清的DMEM培养基正常培养)，各组均放入37℃ 5%CO2孵箱中培养12 h，收集细胞。透射电解下观察凋亡模型组和正常HLEB3组的细胞形态，验证凋亡模型是否成功建立。

1.2.3qRT-PCR检测 Trizol试剂盒收集各组细胞，按说明书要求提取总RNA，逆转录得到cDNA，使用SYBR®Green Kit试剂盒，RNU6B为内参照检测miR-126的相对表达量，β-actin为内参检测KLF6 mRNA的相对表达量。miR-126、RNU6B、KLF6、β-actin的特异性上、下游引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。反应条件：95℃ 40 s，95℃ 10 s，55℃ 35 s，共40个循环，2-△△Ct法计算miR-126、KLF6 mRNA的相对表达量。

1.2.4Western印迹检测 取各转染组HLEB3，加入RIPA细胞裂解液静置40 min，4℃下12 000 r/min恒温离心30 min、取上清；行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入兔抗人KLF6多克隆抗体(1∶200)，4℃缓慢摇动孵育过夜，加入HRP标记的小鼠IgG二抗(1∶1 000)，室温孵育2 h，以GADPH为内参，采用Image J计算目标各带灰度值。

1.2.5细胞凋亡检测 胰蛋白酶消化各转染组细胞，磷酸缓冲液洗涤、2 000 r/min离心10 min、弃上清。使用结合缓冲液将细胞浓度调整至1×105/ml，滴加5 μl Annexin V-FITC/PI双染试剂，常温下避光静置20 min，将细胞转移至冰上，分别加入500 μl 的结合缓冲液，混合均匀后放入流式细胞仪中检测各转染组HLEB3凋亡率。

2 结 果

2.1HLEB3凋亡模型形态学观察及miR-126表达情况 电镜下细胞形态学观察显示，正常HLEB3组形态规则，呈椭圆形，细胞膜结构完整，表面可见较多绒毛突起，细胞核清晰，染色体分布均匀，胞质中内质网和线粒体丰富，无凋亡改变，见图1A、图1B；凋亡模型组表面微绒毛明显减少，细胞核体积减小且形状不规则，核内染色质汇集，存在凋亡特异性标志物-凋亡小体，见图1C、图1D。凋亡模型组中miR-126相对表达量为3.39±0.61，明显高于正常HLEB3组(1.20±0.42，P<0.01)。

图1 正常HLEB3和凋亡模型透射电镜下形态表现(×6 300)

2.2HLEB3转染效率评定 转染48 h后收集细胞，qRT-PCR检测各组miR-126表达情况。结果显示，模拟物组miR-126相对表达量(89.61±12.95)明显高于模拟物阴性对照组(3.75±0.82，P<0.01)；抑制物组miR-126相对表达量(0.52±0.15)明显低于抑制物阴性对照组(3.16±1.24，P<0.01)。

2.3miR-126对HLEB3凋亡的影响 流式细胞术检测显示，模拟物组HLEB3凋亡率〔(0.62±0.11)%〕低于模拟物阴性对照组〔(1.45±0.17)%,P<0.05〕；抑制物组HLEB3凋亡率〔(2.48±0.45)%〕高于抑制物阴性对照组〔(1.52±0.13)%,P<0.05〕。

2.4miR-126靶基因预测 使用目前引用次数最高的miRNA靶基因预测软件(miRanda、miRecords、miRWalk)对 miR-126 靶基因进行预测，KLF6基因与miR-126存在潜在结合位点，可能通过靶向调控KLF6来影响HLEB3凋亡。

2.5miR-126对HLEB3中KLF6 mRNA和蛋白表达的影响 模拟物组HLEB3中KLF6 mRNA相对表达量(0.72±0.17)明显低于模拟物阴性对照组(1.03±0.05)；抑制物组KLF6 mRNA相对表达量(1.95±0.20)，明显高于抑制物阴性对照组(1.10±0.09，均P<0.05)。模拟物组HLEB3中KLF6 蛋白相对表达量(1.95±0.58)明显低于模拟物阴性对照组(3.16±0.75)；抑制物组KLF6 蛋白相对表达量(4.82±0.37)明显高于抑制物阴性对照组(3.20±0.59，均P<0.05)。见图2。

1为模拟物组，2为模拟物阴性对照组，3为抑制物阴性对照组，4为抑制物组图2 各组KLF6蛋白表达的Western印迹电泳图

3 讨 论

随着我国人口老龄化加剧，白内障发病率和总患者数逐年提升，探寻白内障发病机制，对病情防治具有重要意义〔7〕。miRNA在哺乳动物中具有高度同源性，能够与其靶基因配对结合并抑制翻译过程、下调靶基因表达水平，导致基因沉默。最新研究发现miR-126不仅存于肺癌、肝细胞癌、卵巢癌等多种癌组织中，还分布于哺乳动物眼部，在晶状体、角膜上皮细胞中〔8〕。动物实验发现，白内障大鼠的晶状体中miR-126是表达上调最明显的miRNA之一〔9〕，提示其参与白内障进程的可能性较大，但具体机制仍未明确。

本研究显示，在HLEB3凋亡模型中，miR-126表达水平明显高于正常HLEB3；进一步在HLEB3凋亡模型中调节miR-126的表达水平，发现上调miR-126表达会明显促进HLEB3凋亡，下调miR-126表达则明显降低HLEB3凋亡。笔者通过靶基因预测软件得到KLF6基因为miR-126的潜在结合位点，KLF6是一种多功能转录调节因子，在组织抗氧化损伤、维持细胞结构完整和稳定性方面发挥重要作用。相关研究发现，KLF6基因在成年大鼠和人晶状体上皮细胞中均存在高表达〔10〕。本次研究对miR-126可能通过潜在靶基因KLF6调控HLEB3凋亡过程的研究发现，上调miR-126表达会明显降低KLF6基因表达水平，而下调miR-126表达会提升KLF6基因表达水平，提示KLF6基因表达与miR-126呈负相关，miR-126可通过靶向作用于KLF6基因来调控HLEB3凋亡，进而在白内障发病机制中发挥作用，可成为白内障治疗的潜在新靶点。

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3陈晓凯.慢性中心性浆液性脉络膜视网膜病变患者双眼脉络膜厚度频域光相干断层扫描检查价值评价〔J〕.中国卫生工程学，2017；16(2)：213-4.

4高宁宁，宋凡倩，葛红岩.miR-126与眼科疾病的研究进展〔J/OL〕.国际眼科杂志，2017；17(6)：1066-8.

5周 玉，东莉洁，张 红，等.Krüppel样因子6抑制人晶状体上皮细胞增生的研究〔J〕.中华实验眼科杂志，2014；32(4)：325-30.

6郭长艳.线粒体靶向性肽SS-31在H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中的保护作用〔D〕.济南：山东大学，2014.

7李 卉，田 蕊，吴 怡，等.老年白内障患者晶状体中20s Proteasome的表达〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(20)：5125-7.

8李 琳.两种不同超声乳化白内障手术切口位置对白内障患者术后角膜散光的影响〔J〕.中国卫生工程学，2017；16(2)：242-4.

9刘祥龙，贾秋菊，卢国强.零球差与负球差的非球面人工晶体植入术后视觉质量临床研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2016；17(1)：92-4.

10陈再洪.Acrysof Toric人工晶体治疗合并角膜散光老年性白内障的疗效观察〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2015；16(5)：635-7.