烤烟存储期间烟叶酶活性变化的初步研究

王川 刘紫薇 朱启法 张丽娜 马称心 张朝 高琴 陈学平

摘要 [目的]探究初烤烟存储过程中烟叶相关酶活性变化。[方法]以烤烟品种 NC89 为材料，研究皖南地区烟叶存储过程中多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、脂氧合酶（LOX）、苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性随存储时间延长的变化趋势。[结果]随着存储时间变长，几种酶活性均呈现先上升后下降的趋势。其中多酚氧化酶、脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶活性在存儲180 d时分别达到最大值[50.50 U/g，34.20、0.54△OD/（g·min）]，而过氧化物酶活性则在存储270 d时达到最大值（118.90 U/g）。[结论]该研究为进一步丰富烟叶陈化理论，探究烤烟存储质量提升形成机理提供了参考。

关键词 烤烟；存储；酶活性

中图分类号 TS41+1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）15-0001-02

Abstract [Objective]To explore the activity changes of related enzymes in flue-cured tobacco leaves during storage. [Method]We studied the activity change trends of polyphenol oxidase （PPO）， peroxidase （POD）， lipoxygenase （LOX） and phenylalanine lyase （PAL） in tobacco leases with the extension of storage time based on NC89 flue-cured tobacco as experimental material in south Anhui. [Result]As the storage time increased， the activity of four enzymes showed a tendency of increasing first and then decreasing. The maximum activity of polyphenol oxidase， lipoxygenase and phenylalanine were reached when the tobacco were stored 180 days. The maximum were 50.50 U/g， 34.20， 0.54 △OD/（g·min）， respectively， while the peroxidase activity reached the maximum（118.90 U/g） when the tobacco were stored 270 days.[Conclusion]The study provides a reference for further enriching the theory of tobacco leaf aging and exploring the mechanism of improving the quality of flue-cured tobacco during storage.

Key words Flue-cured tobacco；Storage；Enzyme activity

烟叶陈化能够改善烟叶的香味品质，是提高烟叶可用性的重要环节[1]。在烟叶存储期间，烟叶内各种化学变化借助自然气候的变化加速进行，从而改善烟叶品质和理化性状，这一过程被称为自然陈化。酶类是陈化过程中提高烟叶发酵质量的动力，是烟叶陈化的主要机理之一[2]。烤烟存储过程中，在酶类的作用下烤烟烟叶中的多种物质氧化分解形成重要的香气成分，多酚氧化酶、过氧化物酶、脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶则是其中主要的酶类，对促进烟叶陈化发酵、提高烟叶品质具有积极作用。前人[3-6]对初烤烟存储期间相关酶的活性变化进行了大量的研究。为了进一步丰富烟叶陈化理论、探究烤烟存储质量提升形成机理，笔者以皖南地区存储烤烟为材料，研究了烤烟在陈化过程中多酚氧化酶、过氧化物酶、脂氧合酶、苯丙氨酸裂解酶活性的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

以烤烟品种NC89初烤烟为材料，烘烤后于自然条件下储存。每隔45 d取1次样，烟叶去主脉，干燥、粉碎后备用。

1.2 方法

1.2.1 多酚氧化酶活性测定。参照朱广廉等[7]的方法：取1 g样品，加入预冷的0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8）1 mL，研磨，再加1 mL缓冲液，倾入5 mL离心管，于4 ℃、10 000 r/min离心20 min，收集上清液。反应体系为3 mL 0.2 mol/L邻苯二酚（用pH 7.8磷酸缓冲液配制），1 mL酶液，以灭活酶液作为空白对照，于30 ℃下水浴10 min，立即用20%三氯乙酸中止反应。5 000 r/min离心10 min后，取上清液于495 nm处测定其吸光值。

1.2.2 过氧化物酶活性测定。参照李玲等[8]的方法：取1 g样品，加入0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），在冰浴中研磨，12 000 r/min离心20 min，收集上清液。4.7 mL反应液包括2.7 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 5.5），1.0 mL 2%的H2O2，1.0 mL 0.05 mmol/L愈创木酚。向反应液中加入0.3 mL 酶液（空白管为0.3 mL pH 7.0的磷酸缓冲液）混匀后，水浴 37 ℃反应15 min，冷却后测定其在470 nm处的吸光值。

1.2.3 脂氧合酶活性测定。参照宫长荣等[9]的方法：取0.5 g样品，加入0.10 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）在冰浴中研磨，12 000 r/min离心20 min，收集上清液。取0.3 mL酶液于试管中，加入2 mL底物乳状液（2.24 mmol/L亚油酸分散于含0.5 μL/mL吐温-20的0.1 mol/L、pH 9.0的硼酸缓冲液中），混匀后放入30 ℃水浴中并开始计时，反应3 min后加入5 mL无水乙醇终止反应，然后加入5 mL蒸馏水混匀并测定其在234 nm处的吸光值。

1.2.4 苯丙氨酸裂解酶测定。参考张志良等[10]的方法：取1 g样品，加入0.10 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）在冰浴中研磨，12 000 r/min离心20 min，收集上清液。1 mL酶液中加1 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸，2 mL蒸馏水，总体积为4 mL。空白管不加底物，多加1 mL蒸馏水。反应液于30 ℃水浴中反应30 min，反應结束后于290 nm处测定吸光值。

2 结果与分析

2.1 存储期间多酚氧化酶和过氧化物酶活性分析

由图1可知，存储初期多酚氧化酶活性呈现逐渐升高的趋势，存储0～90 d时上升较缓，90～180 d过程中酶活性迅速升高，在180 d时酶活性达到最大值 （50.50 U/g），此时是存储初期多酚氧化酶活性的5.55倍；之后随存储时间延长酶活性迅速降低，至270 d时趋于平稳；存储360 d时，烟叶中多酚氧化酶活性降低到5.48 U/g。

由图2可知，烤烟烟叶过氧化物酶活性在存储初期迅速上升，至180 d后上升趋势变缓，存储270 d时过氧化物酶活性达到最大值（118.90 U/g），此时是存储初期酶活性的17.49倍；之后随存储时间延长酶活性迅速下降，至存储360 d时酶活性降低到34.50 U/g，此时过氧化物酶活性仍显著高于存储初期，是存储初期过氧化物酶活性的5.07倍。

2.2 存储期间脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶活性分析

由图3可知，在烤烟存储过程中，随着时间的延长，烤烟烟叶中脂氧合酶活性变化与多酚氧化酶呈现的先升高后降低的变化趋势基本一致。存储初期脂氧合酶活性不断升高，到180 d时达最高值[34.20△OD/（g·min）]，较存储初期脂氧合酶活性增加了72.55%。而后脂氧合酶活性逐渐下降，存储180～225 d酶活性下降较快，之后下降变缓；存储360 d时脂氧合酶活性为24.10△OD/（g·min）。

由图4可知，存储初期苯丙氨酸裂解酶活性为0.31△OD/（g·min），之后随存储时间延长酶活性持续升高，至存储180 d时达最大值[0.54△OD/（g·min）]，酶活性较存储初期增加了74.19%。之后随时间延长酶活性缓慢下降，至存储315 d后趋于平稳。存储360 d时，苯丙氨酸裂解酶达0.44△OD/（g·min），仍显著高于存储初期。

3 结论与讨论

对皖南地区烤烟烟叶中酶活性的测定结果表明，在存储期间，烟叶中的多酚氧化酶、过氧化物酶、脂氧合酶及苯丙氨酸裂解酶一直具有一定活性，并且具有相似的变化规律：存储初期，4种酶活性均随时间延长而逐渐上升，至存储180 d或270 d后达到最大值，随后酶活性逐渐下降。这与赵铭钦等[11-12]、韩锦峰等[13]的研究结果一致。

在多酚氧化酶和过氧化物酶的共同作用下，烤烟烟叶中的多酚类物质可被氧化成为醌类物质，醌类物质又与氨基酸、蛋白质及其他化合物缩合成大分子物质，形成香气物质的前体物，并赋予烟草制品优雅的香气、改善余味、增加香气量，对提高烤烟烟叶的品质具有良好作用[14-15]。脂氧合酶是脂类物质氧化降解代谢过程中的重要酶。类胡萝卜素在脂氧合酶的作用下可以氧化分解成中间产物香叶醇、紫罗兰酮、紫黄质、黄质醛等，是烤烟烟叶中的重要致香物质[16]。苯丙氨酸裂解酶主要参与烟叶中苯丙氨酸的代谢，烤烟烟叶中许多重要挥发性香气成分如苯甲醇、苯乙醇等的形成均与其代谢密切相关[17]。烤烟烟叶中多酚氧化酶、过氧化物酶、脂氧合酶和苯丙氨酸裂解酶的酶活性在存储期间的动态变化很可能与烟叶表面微生物的活性变化有关。烟叶陈化过程是一个经过烘烤之后不存在生命活性的干物体自然发酵过程。烟叶自身存在的酶在初烤阶段几乎全部高温钝化失活，烟叶自身的细胞结构也遭到破坏。而随着存储时间的延长，酶活性逐渐增加则可能与烤烟烟叶表面的微生物活动有关。烤烟烟叶表面微生物分泌酶从而导致烤烟烟叶的酶活性发生变化，因此烟叶表面的微生物分泌物可能加速烤烟陈化，促进陈化的进行从而改善烤烟烟叶的内在质量。利用微生物进行烤烟的人工陈化可以提高陈化效率，对存储期间烤烟品质的改善具有积极作用，并有待于进一步的深入研究。

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