结直肠癌组织LASP1、MMP-9表达变化及其与患者临床病理参数的关系

薛松，张磊，单长凤，吴正升

(1 淮南市第一人民医院，安徽淮南232007；2 安徽医科大学病理学教研室)

目前对结直肠癌侵袭和转移的机制尚不完全清楚，普遍认为是多个基因共同参与的结果[1～3]。LIM和SH3蛋白1(LASP1)是一个近年发现的与肿瘤侵袭和转移相关蛋白，其在肝癌、乳腺癌等肿瘤组织中过表达，并与肿瘤的发生、发展密切相关[4]。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是MMP家族中的重要成员，可通过降解基底膜和细胞外基质中的Ⅳ型胶原，促进肿瘤侵袭和转移；还可促进内皮细胞迁移，加快新生血管形成，进一步促进肿瘤进展[5，6]。目前国内关于LASP1、MMP-9在结直肠癌侵袭和转移中作用的研究较少。本研究观察了结直肠癌组织LASP1、MMP-9蛋白表达变化，现分析二者表达的关系及其与患者临床病理参数的关系，旨在探讨其在结直肠癌侵袭和转移过程中的作用。现分析结果并报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年1月～2016年12月淮南市第一人民医院收治的结直肠癌患者70例，男40例、女30例，年龄(64.71±9.52)岁。术前均未行任何抗肿瘤治疗，术后经组织病理检查明确诊断。肿瘤直径：≤5 cm 58例，>5 cm 12例；组织分化程度：高分化7例，中分化54例，低分化9例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期45例，Ⅲ、Ⅳ期25例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移45例。本研究经淮南市第一人民医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 LASP1、MMP-9表达检测 采用免疫组化EnVision两步法。取手术切除的结直肠癌组织及其配对的癌旁正常组织(距癌组织边缘>5 cm)，10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。切片常规脱蜡至水，3% H2O2去离子水孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶；蒸锅中加热0.01 mol枸橼酸缓冲液至95 ℃，放入切片水浴15～20 min，自然冷却至室温；10%山羊血清封闭，分别加入LASP1(1∶500)、MMP-9(1∶200)一抗，4 ℃孵育过夜；次日加入二抗和辣根酶标记链霉卵白素37 ℃孵育30 min；DAB显色，苏木素复染，树脂封固，显微镜下观察。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性标本作为阳性对照。①LASP1阳性表达判定：LASP1阳性表达定位于细胞质，呈棕黄色或棕褐色颗粒。每张切片随机选取10个200倍视野，每个视野计数200个细胞，观察细胞染色强度，计算阳性细胞所占比例。细胞染色强度：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞所占比例：无阳性细胞为0分，≤10%为1分，>10%～≤50%为2分，>50%～≤75%为3分，>75%为4分。染色强度和阳性细胞所占比例得分乘积≥2分为LASP1阳性表达[7]。②MMP-9阳性表达判定：MMP-9阳性表达定位于细胞质，呈棕黄色或棕褐色颗粒。每张切片随机选取10个200倍视野，每个视野计数200个细胞，观察细胞染色强度，计算阳性细胞所占比例。细胞染色强度：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞所占比例：≤5%为0分，>5%～≤25%为1分，>25%～≤50%为2分，>50%～≤75%为3分，>75%为4分。细胞染色强度和阳性细胞所占比例得分相加≥2分MMP-9阳性表达[6]。所有切片由2名病理科医师盲法独立阅片，结果不一致时协商判定。

1.3 结直肠癌组织LASP1、MMP-9阳性表达的关系及二者与患者临床病理参数的关系分析 采用Spearman非参数相关分析法分析结直肠癌组织LASP1阳性表达与MMP-9阳性表达的关系。收集结直肠癌患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度、临床分期、淋巴结转移资料，分析LASP1、MMP-9阳性表达与患者临床病理参数的关系。

1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman非参数相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁正常组织LASP1、MMP-9阳性表达比较 结直肠癌组织与癌旁正常组织LASP1阳性表达率分别为64.3%(45/70)、35.7%(25/70)，MMP-9阳性表达率分别为58.6%(41/70)、27.1%(19/70)。二者比较P均<0.05。

2.2 结直肠癌组织LASP1阳性表达与MMP-9阳性表达的关系 Spearman非参数相关分析显示，结直肠癌组织LASP1阳性表达与MMP-9阳性表达呈正相关关系(r=0.664，P<0.01)。

2.3 结直肠癌组织LASP1、MMP-9阳性表达与患者临床病理参数的关系 见表1。

3 讨论

LASP1最初由Christine于1995年首次报道，主要结构域由氨基端的一个LIM(Lin/Is1/Mec)和两段伴肌动蛋白样重复序列和羧基端一个scr同源结构域(SH3)组成[8]。LASP1蛋白是LIM蛋白亚家族成员之一，通过LIM结构的介导与细胞膜上突起的肌动蛋白直接发生作用，还可通过SH3区域在细胞伪足形成、延伸及侵袭方面发挥作用[9]。近年研究发现，在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等组织中LASP1过表达，其表达变化与肿瘤发生、发展及侵袭、转移有关[10～12]。本研究结果显示，结直肠癌组织LASP1阳性表达率明显高于癌旁正常组织；LASP1阳性表达与肿瘤临床分期和淋巴结转移有关，而与患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关。提示LASP1可能参与结直肠癌的侵袭和转移，与上述报道基本一致。

表1 结直肠癌组织LASP1、MMP-9阳性表达与患者临床病理参数的关系

细胞外基质和基底膜的降解破坏是肿瘤侵袭和转移过程中的关键步骤之一。MMPs是一组重要的蛋白水解酶家族，通过降解细胞外基质和基底膜成分以及一些非基质成分，改变肿瘤细胞微环境，继而促进肿瘤侵袭和转移。MMP-9作为MMPs的一个亚型，除参与降解细胞外基质外，还参与肿瘤新生血管形成及调节细胞黏附等作用，在肿瘤侵袭和转移过程中发挥重要作用[13]。Tsai等[14]研究发现，在具有侵袭和转移能力的口腔鳞癌细胞中MMP-9表达明显升高，说明MMP-9高表达可能与口腔鳞癌的侵袭和转移有关。本研究结果发现，结直肠癌组织MMP-9阳性表达率明显高于癌旁正常组织；MMP-9阳性表达与肿瘤临床分期和淋巴结转移有关，而与患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度无关。提示MMP-9可能参与结直肠癌的侵袭和转移，与上述报道基本一致。

本研究还发现，结直肠癌组织LASP1阳性表达与MMP-9阳性表达呈正相关关系，说明二者在促进结直肠癌侵袭和转移过程中可能具有协同作用。

综上所述，结直肠癌组织LASP1、MMP-9表达升高；二者表达变化可协同促进结直肠癌侵袭和转移。

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