7种非洲多发病毒病基于荧光微球的多元核酸检测方法的建立与初步评价

闫芳域 殷强玲 李阿茜 芜为 李川 梁米芳 李德新 李建东

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

随着全球经济一体化及现代交通运输方式的快速发展，传染病跨境传播的风险不断加大。多种危害严重的重要传染病，如埃博拉(ebola virus disease， EVD)、马尔堡(marburg virus disease, MVD)、黄热病(yellow fever, YF)、拉沙热 (lassa fever, LF)、克里米亚-刚果出血热病毒(crimean-congo hemorrhagic fever, CCHF)、裂谷热(rift valley fever, RVF)、基孔肯雅热(chikungunya fever, CHIK)等均源于非洲[1-3]。我国与非洲交往日益增多，非洲重要病毒病存在输入国内的风险。本研究针对在非洲高发且具有严重公共卫生危害的重要病毒病，以Luminex微流系统为平台，建立基于荧光微球的核酸多元检测方法，并完成了初步的评价。

1 材料与方法

1.1材料RVFV、 CCHFV、MARV、 ZEBOV、LASV的N、GP基因，和CHIKV的E1基因和YFV NS5基因由公司化学合成。xMAP荧光微球购自Bio-Rad公司，1.2 μm的96孔滤模板购自Millipore公司。

1.2引物和探针应用Primer Express 3.0(美国Thermo公司)设计引物和探针，并用primer-BLAST验证特异性。在探针5′端进行12个碳原子连接臂的氨基修饰以偶联微球。在反向通用引物的5′端引入生物素标记。

1.3参考品及模拟样本制备使用带有T7启动子序列的引物，扩增上述病毒基因序列，作为模板，采用RiboMAX large scale RNA production systems SP6/T7 kit (美国Promega公司) 进行体外转录。DNase I进行消化后，使用RNeasy Mini Kit(德国Qiagen公司) 进行纯化。并用Nano drop和凝胶电泳的方法进行定量。

1.4基于荧光微球的核酸检测检测过程包括荧光微球与探针偶联、样本核酸提取、多重PCR扩增、杂交检测等过程。

1.4.1 荧光微球与探针偶联：参照试剂盒说明书，使用EDC(美国Thermo公司)将氨基修饰的探针和羧基修饰的微球在室温避光条件下偶联，微球避光储存于4 ℃条件。

1.4.2 PCR扩增：采用One Step RT-PCR kit试剂盒(德国Qiagen公司)进行Tem-PCR扩增[7]，分为5个阶段，①反转录50 ℃ 30 min, ②热启动95 ℃ 10 min, ③加标签 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min共10个循环，④大规模扩增 95 ℃ 30 s, 48℃1 min, 72℃1 min共30个循环。⑤延伸 72 ℃ 7 min。

1.4.3 杂交检测： 一个反应体系中包括33 μl 1.5×TMAC微球溶液，约含有5 000个荧光微球，10 μlTris-EDTA溶液(pH=8.0)，7 μl多重PCR产物。设置3个复孔，在95 ℃ 3 min；50℃30 min条件下孵育。产物移入被鞘液润湿的在50 ℃条件下预热的96孔滤模板中，真空泵抽滤，加入100 μl，1.5×TMAC溶液，轻微震荡后真空泵抽滤，加入使用1×TMAC溶液稀释的3 μg/ml的链霉亲和素-藻红素(美国Prozyme公司)溶液，50 ℃条件下避光孵育10～5 min。真空泵抽滤后加入100 μl 1.5×TMAC使用Luminex Calibrate Kit(美国Bio-Rad公司)调试Luminex Bioplex 200，按照操作手册上机检测读值，并以荧光中位值(Median fluorescence intensity, MFI) ≥阴性对照均值+3倍标准差为阳性判定标准。

1.5检测限、特异性及稳定性评价对RNA参考品进行10倍系列稀释，达到101～108拷贝/ μl，评价检测限并与Real-time PCR方法对比。分别选取105和107拷贝/μl的参考品，重复实验3次，每次设置3个复孔，计算其组内和组间变异系数，评价稳定性。选用30份ZIKA、DENV和SEOV病毒等疑似病例样本、7种病毒核酸模拟样本及32份正常人血清样本评价方法的特异性。

2 结果

2.1引物和探针设计引物、探针模拟验证后，采用Tem-PCR原理[4]，在正反向引物5′末端添加通用引物(表1)，实现靶基因片段多重扩增的。

2.2参考品制备以公式RNA浓度(拷贝/ μl)=浓度(g/ μl) ×6.02×1023/转录片段长度(核糖核酸数量)×340计算出参考品浓度。定量之后10倍系列稀释，获得101-108拷贝的体外转录产物。

2.3检测限利用10倍系列稀释的RNA参考品分别进行单重和7重的核酸检测， 绘制检测曲线(图1)，与Real-time PCR方法的检出限对比 (表2)。

2.4特异性选取108拷贝/ μl 7种病毒的的RNA为模拟样本，进行交叉反应检验，结果显示7种病原体之间无明显非特异性交叉反应；对30份寨卡病毒(Zika virus, ZIKA)、登革病毒(Dengue virus, DENV)和汉城病毒(Seoul virus, SEOV)的模拟患者标本、32份健康人血清标本进行检测，特异性为100%(图2)。

2.5稳定性对浓度为105拷贝/ μl和107拷贝/ μl 的7种病原靶基因参考品进行3次重复性检测，结果显示组内变异系数均小于12%，组间变异系数均小于15%，经方差分析P>0.11，组内组间测量值统计学差异无统计学意义，(图3)。

A:RVFV; B: YFV; C:MARV; D:ZEBOV; E:LASV; F:CCHFV; G: CHIKV图1 不同浓度病毒RNA多重检测曲线Fig.1 Multiplex detection curves of viral RNA under different concentration

图2 基于荧光微球的核酸检测方法的特异性评价Fig.2 Evaluation of specificity of the fluorescent bead-based multiplex PCR assay

A: 样本浓度为107拷贝/ μl; B: 样本浓度为105拷贝/ μl图3 基于荧光微球的核酸检测方法的稳定性评价A: Sample concentration at 107copies/ μl; B: Sample concentration at 105copies/ μlFig.3 Evaluation of the reproducibility of the fluorescent bead-based multiplex PCR assay

3 讨论

随着航空业的快速发展，国家间经贸合作交流的增加，传染病跨界传播的风险不断加大。2016年，安格拉黄热疫情暴发，中国报道了11例输入性病例[5]。2014年，西非埃博拉疫情大暴发，病例传入美国、英国等国家，并在尼日利亚，刚果引发暴发疫情[6]。登革热、基孔肯雅热、黄热等虫媒传染病，均不断发生跨境传播，引起全球范围的流行[7]。

表1 七种非洲地区多发病毒病核酸检测引物与探针序列Tab.1 The primers and probes of seven viral diseases with a high incidence in Africa

*：本研究中所用探针均在5′端偶联12个碳原子，充当连接臂，并进行氨基修饰，以便偶联到荧光微球表面

*: All the probes in this research are coupled with 12 C atoms at 5′ end as a link arm and were amino-modified to connect to the surface of the fluorescent beads

目前，病毒病的实验室检测方法主要包括检测病毒抗体的血清学检测方法，检测病毒抗原、核酸以及分离病毒等病原学检测方法。Real-time PCR方法经济、简单、方便，广泛用于特定病原体检测、监测或常见病的检测，但由于通量的限制，难以用于罕见病原体的筛查。Luminex等基于荧光微球的核酸检测平台利用微球和不同荧光编码技术，可以针对少量样本开展高通量检测。在血清学特异性抗体检测中，由于整个检测过程均在液相中进行，增加了反应接触面积和几率，较经典ELISA反应具备更高的敏感性和特异性[8-9]。基于该项技术的核酸检测方法，在国内、外也开展相关研究，主要集中在呼吸道病毒和肠道病毒的组合检测中，临床样本检出率可达80%～100%，针对呼吸道病毒的商业化试剂盒，检测限约为10-1TCID50，特异性为95%～100%[10]。

表2 单重和多重检测及Real-time PCR的敏感性分析

Tab.2Analytical sensitivity of single and multiple test and real-time PCR

本研究中建立的7种非洲地方性流行的病毒病多元检测方法包括样本核酸提取、核酸特异性扩增富集、分子杂交和基于荧光微球的检测4个模块，为了增加反应的灵敏性，分模块对反应体系进行优化，检出限约为102-5拷贝/ μl，为可能输入的重要传染病检测提供新的手段和方法。基于荧光编码微球的检测技术，反应物在液相间相互作用，与自然状态下的作用环境相似，有助于提升检测的敏感性和特异性。同时，随着编码技术和微流系统的改进以及检测过程的不断优化，基于荧光微球的检测技术将得到更广泛的应用。

利益冲突:无

参考文献

[1] Petersen J, Simons H, Patel D. Amplification of perceived risk among users of a national travel health Web site during the 2013-2016 West African Ebola virus outbreak[J].Am J Infect Control, 2018,pii:s0196-6553(17)31257-31259.DOI: 10.1016/j.ajic.2017.11.012.

[2] Buba MI, Dalhat MM, Nguku PM， et al. Mortality Among Confirmed Lassa Fever Cases During the 2015-2016 Outbreak in Nigeria[J]. Am J Public Health, 2018，108(2): 262-264. DOI: 10.2105/ajph.2017.304186.

[3] Pigott DM, Deshpande A, Letourneau I， et al. Local, national, and regional viral haemorrhagic fever pandemic potential in Africa: a multistage analysis[J]. Lancet, 2017， 390(10113): 2662-2672. DOI: 10.1016/s0140-6736(17)32092-5.

[4] Han J, Swan DC, Smith SJ, et al. Simultaneous amplification and identification of 25 human papillomavirus types with Templex technology [J]. J Clin Microbiol, 2006，44(11): 4157-4162. DOI: 10.1128/jcm.01762-06.

[5] Ling Y, Chen J, Huang Q， et al. Yellow Fever in a Worker Returning to China from Angola, March 2016[J]. Emerg Infect Dis, 2016，22(7):1317-1818. DOI: 10.3201/eid2207.160469.

[6] Dixon MG, Schafer IJ. Ebola viral disease outbreak—West Africa, 2014[J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep， 2015,65(1):114-115. DOI: 10.1016/j.annemergmed.2014.10.010.

[7] Cella E, Riva E, Salemi M et al. The new Chikungunya virus outbreak in Italy possibly originated from a single introduction from Asia[J]. Pathog Glob Health, 2017，11(28):1-3. DOI: 10.1080/20477724.2017.1406565.

[8] Wu W, Zhang S, Qu J， et al. Simultaneous detection of IgG antibodies associated with viral hemorrhagic fever by a multiplexed Luminex-based immunoassay[J]. Virus Res, 2014，187(1): 84-90. DOI: 10.1016/j.virusres.2013.12.037.

[9] Kamminga S, van der Meijden E, Wunderink HF， et al. Development and evaluation of a broad bead-based multiplex immunoassay to measure IgG seroreactivity against human polyomaviruses[J]. J Clin Microbiol, 2018，01(1): 115-118. DOI: 10.1128/jcm.01566-17.

[10] Munro SB, Kuypers J, Jerome KR. Comparison of a multiplex real-time PCR assay with a multiplex Luminex assay for influenza virus detection[J]. J Clin Microbiol， 2013，5(1):1124-1129. DOI: 10.1128/jcm.03113-12.