兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

刘少伟，姜 欢，王晓龙，李梦红，陈 玉，唐中元，胡 敏

(1.吉林大学口腔医院正畸科，吉林 长春 130021； 2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林 长春 130021；3.吉林大学口腔医院老年病科，吉林 长春 130021)

在正畸临床治疗中，应用适当的力值可以使牙齿周围的牙槽骨和牙周组织不断发生适应性改建从而使牙齿发生移动，但不当的机械压力会导致受压侧牙骨质发生病理性牙根外吸收。研究[1-2]表明：介导牙根外吸收的破牙骨质细胞与介导骨吸收的破骨细胞(osteoclast，OC)在形态、功能上相似。OC是由骨髓造血干细胞分化的单核-巨噬细胞经过进一步融合而成的多核细胞，其在骨吸收活动中起重要作用[3]。蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)是细胞信号转导过程中的关键酶，参与了OC的分化、黏附及活性的调节等重要过程[4-6]。

1996年Wu等[7]首次从兔破骨细胞cDNA文库中通过分子克隆的方法分离了一段独特的PTP序列，称之为破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP-oc)，并证实PTP-oc是一种结构独特的受体型跨膜PTP。PTP-oc主要表达于造血细胞[B淋巴细胞和单核细胞-巨噬细胞系的细胞(OC前体细胞)]和成熟OC中，其表达具有细胞类型特异性[8-10]。近年来学者[11-14]发现PTP-oc是破骨细胞形成中的关键因子，对OC的活性有重要的调控作用，其通过信号转导激活c-src PTK活性以及c-src依赖的NF-κB 和JNK2信号通路[13]，并且可以正调节Rac-GTP酶活性，负调节 Rho-GTP酶活性，差别性地调控Rac和Rho信号通路从而抑制EPHA4信号通路[15]。为了进一步了解PTP-oc在细胞信号转导通路中的作用机制，便于后期进一步研究PTP-oc的功能，本研究首次制备兔抗多克隆抗体，并鉴定其效价和特异性。本课题组前期研究[16]已成功构建pET28a-ΔPTP-oc重组质粒，因此本研究采用该重组质粒转化入BL21(DE3)菌中进行原核蛋白表达，纯化重组蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞、实验动物和主要试剂 pET28a-ΔPTP-oc重组质粒、BL21(DE3)和RAW264.7细胞均由吉林大学生命科学学院费舍尔实验室提供。新西兰大白兔由吉林大学生命科学学院动物实验中心提供并饲养，动物合格证号：SYXK(吉)2014-0012。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-bD-thiogalactopyranoside,IPTG,TaKaRa公司，日本)，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma公司，美国)，Costar96孔酶标板(百金生物科技公司，中国)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG(博奥森公司，中国)，超敏ECL化学发光试剂盒(TransGen Biotech公司，中国)，Protein A 琼脂糖(Invitrogen公司，美国)。

1.2 重组蛋白质的表达 将pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化入BL21(DE3)感受态中，挑菌，由吉林省库美公司进行鉴定。将鉴定正确、成功转化的BL21(DE3)菌种10 μL用1 mL LB液体培养基活化，过夜，第2天扩大再培养至200 mL LB液体培养基中，当菌液吸光度(A)值达到0.4时采用0.1 mmol·L-1IPTG在16℃、24 h条件下诱导表达。收集诱导后菌体，采用20 mL PBS重悬后7 000 r·min-1离心10 min，实验重复3次。收集离心后的菌体采用Extraction Buffer(50 mmol·L-1Tris-HCl,pH7.4，2 mmol·L-1EDTA，2 mmol·L-1β-巯基乙醇,20% glycerol)加入1 mmol·L-1苯甲脒,0.1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟,1 mmol·L-1抑肽素在冰水浴中进行超声破碎，破碎后菌液在4℃、130 000 r·min-1离心30 min获取上清。

1.3 重组蛋白质的纯化 利用Q柱阴阳离子交换和Ni-NTA镍离子亲和层析纯化上清获得PTP-oc重组蛋白质。使用Q柱阴阳离子交换的步骤：先用5倍柱体积的Equilibrate Buffer Q(50 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1EDTA、1 mmol·L-1β-巯基乙醇、20% 甘油,pH 7.4)平衡Q柱，上样，使用含有不同浓度梯度NaCl的Elution Buffer Q(50 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1EDTA、1 mmol·L-1β-巯基乙醇、20% 甘油,pH7.4)洗脱重组蛋白，NaCl浓度依次为0.2、0.4和0.6 mol·L-1；对硝基苯磷酸盐法(PNPP)检测发现：当NaCl浓度为0.6 mol·L-1时可使目的重组蛋白从Q柱洗脱。随后将洗脱的重组蛋白再使用Ni-NTA镍离子亲和层析进一步纯化，步骤简述如下：先用5倍柱体积的Equilibrate Buffer Ni(50 mmol·L-1Tris-HCl、20% 甘油，pH 7.4)平衡Ni-NTA柱，随后将由Q柱纯化后的重组蛋白上样，使用Washing Buffer Ni(50 mmol·L-1Tris-HCl、20% 甘油、0.5 mol·L-1NaCl,pH 7.4)洗去杂蛋白，采用Elution Buffer Ni(50 mmol·L-1Tris-HCl、20% 甘油、50 mmol·L-1Imidazole,pH 7.4)洗脱目的蛋白，获得纯化的PTP-oc重组蛋白，所有操作均在4℃条件下进行。纯化后的蛋白采用SDS-PAGE鉴定。

1.4 PTP-oc多克隆抗体的制备 新西兰大白兔在新环境下饲养1周后耳缘静脉采血，作为阴性对照。将纯化的PTP-oc重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分研磨，使其完全乳化。采用背部皮下多点注射，首次免疫蛋白为500 μg。在免疫后第14、21和28天，将PTP-oc 重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化，进行加强免疫，加强免疫蛋白为250 μg。在免疫第35天由兔耳缘静脉取血，采用间接ELISA法对血清效价进行检测。

1.5 间接ELISA法检测PTP-oc抗血清效价 将PTP-oc纯化蛋白用包被液(0.05 mol·L-1碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至10 mg·L-1，在96孔酶标板中每孔加入100 μL，4℃过夜。以不加样品孔为空白对照，加免疫前血清孔为阴性对照。次日去除包被液，PBST(0.01 mol·L-1PBS，含0.1% Tween20)振荡洗涤3次，每次5 min；每孔加入300 μL含2% BSA的封闭液，37℃封闭2 h。去除封闭液，PBST振荡洗涤3次，每次5 min。分别加入稀释的免疫前血清及抗血清，选择倍比稀释，每孔加入100 μL，37℃孵育90 min。PBST振荡洗涤3次，每次5 min；加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG (1∶5 000)，每孔加入100 μL，置于37℃孵育45 min。PBST振荡洗涤3次，每次5 min；每孔加入TMD显色液100 μL，37℃避光反应20 min;随后每孔加入100 μL终止液(0.5 mol·L-1硫酸)，终止反应，于酶标仪上读数[17]。[(实验组A(450)值-空白组A(450)值]/[(阴性组A(450)值-空白组A(450)值]≥2.1 者为抗血清阳性。

1.6 PTP-oc多克隆抗体的纯化 采用Protein A琼脂糖纯化血清中的抗体：采用1 mL Protein A琼脂糖装柱后，加入5 mL结合缓冲液(0.15 mol·L-1NaCl、0.02 mol·L-1Na2HPO4，pH 7.0)平衡，将血清用结合缓冲液稀释(1∶5)，稀释后将血清过柱，待血清全部流过柱子后用10 mL洗脱缓冲液(0.15 mol·L-1NaCl、0.02 mol·L-1Na2HPO4，pH 7.0)洗柱，随后采用5 mL洗脱液(0.1 mol·L-1Glycine，pH 3.0)洗脱，洗脱结束后立即在每1 mL甘氨酸洗脱液中加入0.1 mL、1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，所得洗脱液中加入叠氮钠后-80℃保存。纯化后的抗血清应用SDS-PAGE和考马斯亮蓝鉴定，结果以条带强弱显示。

1.7 Western blotting法检测RAW264.7细胞中PTP-oc的表达 收集由RANKL诱导第5天的RAW264.7细胞[18]，采用蛋白裂解液裂解后离心(13 000 r·min-1、30 min、4℃) 取上清液，进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，随后转移至PVDF膜(200 mA、80 min)上，采用 0.3% BSA 37℃封闭 2 h,用抗血清作为一抗(1∶7 000稀释)，4℃条件下孵育过夜。TBST洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000 稀释)，37℃孵育2 h，TBST洗膜3次后，采用ECL化学发光法检测。

2 结 果

2.1 重组蛋白质的表达和纯化 通过Q柱阴阳离子交换和Ni-NTA镍离子亲和层析，所得样品在30 000处显示出单一条带，与预测目的条带大小一致，且纯度较高，其纯度可用于免疫家兔制备多克隆抗体。见图1。

M:Protein marker；Lane 1:Supernatant after centrifugalization；Lane 2：Sediment after centrifugalization；Lane 3:Supernatant flowed through Q fast flow agarose；Lane 4:Sample flowed through Ni-NTA；Lane 5:Purified recombinant PTP-oc protein.

图1 SDS-PAGE法检测重组PTP-oc蛋白表达和纯化电泳图

Fig.1 Electropherogram of expression and purification of recombinant PTP-oc protein detected by SDS-PAGE method

2.2 PTP-oc抗血清效价 在第4次免疫1周后采用间接ELISA法对兔抗血清的效价进行检测，ELISA法检测结果显示：在第4次免疫后抗血清效价达到1∶32 000以上，表明重组蛋白质PTP-oc经过4次免疫家兔后诱导家兔机体产生了抗PTP-oc的特异性抗体，可对家兔取血分离血清。 见表1。

表1 间接 ELISA 法检测兔PTP-oc抗血清效价

2.3 PTP-oc多克隆抗体纯化 将经Protein A琼脂糖纯化的血清中IgG经过SDS-PAGE电泳，从电泳结果中可以看出纯化后的IgG在50 000和25 000处具有2个特异性的条带，与IgG 重链和轻链大小一致，制备的兔抗PTP-oc多克隆抗体的纯化效果较好。见图2。

M：Protein marker;Lane 1:PTP-oc polyclonal antibody.

Fig.2 Electropherogram of purification of PTP-oc polyclonal antibody detected by SDS-PAGE method

2.4 RAW264.7细胞中PTP-oc蛋白的表达 以兔抗血清作为一抗，Western blotting法检测结果显示：诱导后RAW264.7细胞在47 000处出现特异性反应条带，大小与预测的RAW264.7细胞中PTP-oc蛋白大小一致，说明制备的抗PTP-oc多克隆抗体特异性较好。见图3。

3 讨 论

牙根外吸收是临床正畸治疗过程中常见的并发症之一，是由机械力引发的受压侧牙骨质出现破牙骨质细胞所导致的病理性吸收。在正畸压力作用下，牙根周围产生各种炎症因子(白细胞介素和肿瘤坏死因子α等)，激活RANK和RANKL信号通路使得OC和破牙骨质细胞分化成熟[19]，而这一过程中OC中酪氨酸的磷酸化起重要作用[20]。PTPs作为细胞信号转导过程中的关键酶，与蛋白酪氨酸激酶(PTKs)共同调控酪氨酸残基的磷酸化，在细胞的信号转导和增殖分化等过程中起至关重要的作用[21]。Wu等[7]首次证实：PTP-oc是一种结构独特的受体型跨膜PTP，其相对较短，仅由405个氨基酸残基组成，其细胞外结构域很短，只有8个氨基酸，并且缺乏近N端的信号肽段，因此PTP-oc并不是典型的受体型PTP。PTP-oc与1种肾的受体型PTP,即GLEPP1[22](亦称PTP-U2、PTPRO、CRYP2、PTPBK或PTPRO-FL)在跨膜区域和细胞中结构域的序列相同，且两者均是由PTPRO基因所调控，但是两者的启动子不同，远端的启动子编码GLEPP1，主要在肾、脑、脾和造血干细胞中表达，而近端启动子编码的是PTP-oc,主要表达于造血干细胞和成熟的OC[7]。

M:Protein marker；Lane 1:PTP-oc;A：PTP-oc polyclonal antibody；B：GAPDH.

图3 Western blotting法检测RAW264.7细胞中PTP-oc蛋白表达电泳图

Fig.3 Electrophoregram of expression of PTP-oc protein in RAW264.7 cells detected by Western blotting method

Suhr等[11]使用反义寡聚脱氧核苷酸抑制兔OC中的PTP-oc，降低了OC的骨吸收能力；Amoui等[13]发现：在RAW264.7细胞诱导的破骨样细胞中过表达PTP-oc时，促进了该细胞向OC的分化，并且增强了骨吸收能力。c-src PTK的活性对成熟OC的功能活性有重要影响[23]，c-src PTK的活性主要取决于其527位点酪氨酸的磷酸化状态，当527位点的酪氨酸被磷酸化时，其PTK活性受到抑制；当527位点的酪氨酸去磷酸化时，其PTK活性被激活，从而调节OC的活性。PTP-oc可以使OC的c-src PY527去磷酸化[24]，从而激活c-src PTK的活性以及c-src依赖的NF-κB和JNK2信号通路的激活[13]，最终使得OC活化并增强了OC的骨吸收活动，即PTP-oc可以正向调节c-src PTK的活性。Lau等[15]发现：PTP-oc还可以通过去磷酸化EPHA4的关键磷酸酪氨酸残基，使得EPHA4失活，从而抑制EPHA4信号通路，提高OC的活性。上述研究结果均显示：PTP-oc对于破骨性吸收有重要的正向调节作用。Yang等[25]通过靶向敲除PTP-oc的启动子，从而阻止了RANKL介导的OC的分化，说明PTP-oc在OC的分化过程中也起重要作用。

本实验采用本课题组前期构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒，成功转化至BL21(DE3)中诱导重组蛋白的表达。在纯化重组蛋白时采用Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析方法，这与本课题组前期研究[15]仅采用Ni-NTA镍离子亲和层析比较，获得的重组蛋白纯度有明显的提高，利用纯化的PTP-oc重组蛋白免疫家兔成功地制备了多克隆抗体，经检测鉴定后发现抗体的效价和特异性均较高，并采用Western blotting法检测RAW264.7细胞中PTP-oc的表达，为后续进一步研究PTP-oc在OC中的功能和作用机制奠定了基础。

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