利用DNA Shuffling技术构建重组PRRSV ORF5基因

刘建奎，魏春华，黄春芳，陈小燕，戴爱玲，杨小燕

龙岩学院生命科学学院 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室 福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩 364000

猪繁殖与呼吸综合征 (Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV) 引起的一种全球性的猪病毒性传染病[1-3]。PRRS于1996年在我国大陆首次暴发，随后该病迅速蔓延暴发，成为我国规模化养猪场主要疫病之一。2006年，在我国南方地区暴发的高致病性PRRSV (Highly Pathogenic PRRS Virus，HP-PRRSV)，给我国的养猪业造成了严重的经济损失[4-5]。2013年国内出现了新流行毒株，该毒株与2008年美国分离到的NADC30毒株亲缘关系较近，称之为NADC30-like PRRSV，随后迅速蔓延至全国多个省市，给猪场防控PRRS带来了严峻挑战[6-8]。由于PRRSV存在多种基因型，不同基因型的毒株在抗原性方面有很大的差异，导致现有的疫苗尚不能完全有效地防控所有或大部分PRRSV流行毒株。GP5蛋白为ORF5编码的一种高度糖基化的蛋白，是PRRSV基因组中变异最大的结构蛋白。GP5是PRRSV最主要的保护性抗原，含有与病毒中和作用和免疫保护相关的表位，能诱导机体产生中和抗体[9-10]。此外，PRRSV侵入机体后，主要产生的是针对GP5蛋白的中和抗体，因此GP5蛋白成为研制新型疫苗的首选蛋白[11-12]。

DNA shuffling技术是由Stemmer[13]于1994年首先提出的，是一项全新的体外人工进化模式，通过基因在分子水平上的重组，再以定向筛选具有预期形状的突变体，获得同时具有多个亲本基因特征的突变基因。如今DNA shuffling技术在生物工程的领域得到了广泛的应用。在对病毒载体的改造方面，Maxygen公司利用DNA shuffling对4种相关但抗原不同的登革热毒株改造后，获得了突变抗原，其产生的抗体能与4种亲本毒株发生免疫反应[14]。目前利用DNA shuffling技术将处于不同进化分支的 PRRSV的某个或某些基因构建到 PRRS感染性克隆骨架中，动物实验证实构建的嵌合病毒能对亲本毒株产生部分交叉保护[15]。另外 DNA shuffling 还应用在对细胞因子、启动子、目的蛋白等方面的改造[16]，均表现出了不可替代的优势和良好的前景。

本实验利用DNA shuffling技术，对处于不同遗传分支的PRRSV ORF5基因进行重组，获得重组的 ORF5基因，再将其连接原核表达载体进行原核蛋白表达，以期利用重组 ORF5蛋白免疫动物后能产生针对大部分甚至所有亲本PRRSV的中和抗体，为研究新型PRRSV疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株和细胞

2012-2016年由本实验室分离的处于不同进化分支的4株PRRSV毒株 (FJ01、FJ03、FJ10和FJZ03)以及Marc-145细胞由龙岩学院生命科学学院保存。

1.2 主要试剂

PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DNA marker、T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ、IPTG (24 mg/mL) 和 DNA A-Tailing Kit购自大连宝生物公司；DNaseⅠ酶购自Sigma公司；普通琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒、BL21感受态细胞购自天根生化科技有限公司。

1.3 PCR引物

参考VR2332、CH-1a、JXA1和NADC30毒株的序列设计2对特异性引物P1/P2和P3/P4，分别扩增PRRSV ORF5基因全长和去除信号肽区域的△ORF5基因 (表 1)，引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

表1 扩增PRRSV ORF5和△ORF5基因的引物序列Table 1 Primers used for construction of ORF5 and △ORF5 of PRRSV

1.4 PRRSV ORF5基因DNA Shuffling

1) 按照RNA提取试剂盒说明书提取4株病毒的RNA，按TaKaRa试剂盒说明书，采用两步法用引物 (P1/P2) 进行 RT-PCR扩增，1%凝胶电泳分析PCR产物，用DNA纯化回收试剂盒回收和纯化目的条带。

2) 将回收纯化后的处于不同遗传分支的ORF5基因用DNaseⅠ酶消化成大小约为50-150 bp的片段，反应体系为 25 μL：纯化的 DNA 2.0 μL，DNaseⅠ0.1μL，缓冲液 1 μL，ddH2O 4 μL。反应程序：16 ℃ 3 min，加入 1 μL Stop solution for DNaseⅠ，终止反应。酶切产物置于 3%琼脂糖凝胶中电泳，用 DNA纯化回收试剂盒进行回收目的条带。

3) 无引物扩增：回收产物2.0 μL，5×Primer STAR缓冲液5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O补足25 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 4 min ；95 ℃30 s，60 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，51 ℃30 s，48 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃2 min；共30个循环，72 ℃ 7 min。4 ℃保存。

4) 有引物扩增：无引物扩增后的 DNA产物2.0 μL， 5×Primer STAR 缓 冲 液 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物 (P3/P4)各 0.5 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O补足25.0 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min ，4 ℃保存。反应结束后，进行1%的琼脂糖凝胶电泳。

1.5 重组ORF5基因的鉴定

将回收纯化后的 PCR产物连接到 pMD19-T载体上，挑选 50个阳性重组质粒送往北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

1.6 重组 PET32-△2ORF5基因的原核表达及纯化

根据测序结果选取△2ORF5作为目的基因，通过双酶切 (BamHⅠ和HindⅢ) 将△2ORF5基因连接到 pET32a载体上进行蛋白表达。将pET32a-△2ORF5重组质粒的菌液按照 1∶50比例接种至 100 mL LB培养基中，至吸光光度值OD600达到0.5-0.6时，加入1 mmol/L IPTG进行诱导蛋白表达。收集菌体，进行 SDS-PAGE，观察蛋白的表达情况，按照全式金公司蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化。

1.7 Western blotting检测

将纯化的重组 pET32a-△2ORF5蛋白与弗氏完全佐剂等比例进行乳化，腹腔注射 SPF BALB/c小鼠，2周后以弗氏不完全佐剂与重组蛋白充分乳化后第二次加强免疫，二免后14 d眼球采血分离血清备用。

将未纯化 4株毒株的 (FJ01、FJ03、FJ10和FJZ03) 重组pET32a-ORF5蛋白进行SDS-PAGE，然后转印至硝酸纤维素膜上，以鼠抗血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，在DAB溶液中显色并观察结果。

1.8 病毒抑制试验

将制备的鼠抗血清灭活后，进行倍比稀释分别与等体积 200TCID 的 FJ01、FJ03、FJ10、FJZ03 PRRSV混合，参考马玲等建立的方法测定多克隆抗血清对病毒感染细胞的抑制率[17]。

2 结果与分析

2.1 PRRSV ORF5基因遗传进化分析

通过设计的引物P1/P2对4株PRRSV (FJZ03、FJ01、FJ03和FJ10) 进行ORF5基因扩增，扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后，结果显示扩增后片段与目的片段大小一致，约为750 bp (图1)。利用MEGA6.0软件对ORF5序列进行了比对和分析。结果表明，4株PRRSV处于不同的进化分支，FJ01与VR2332等处于同一进化分支为经典毒株。FJZ03与NADC30处于同一进化分支，为新流行的NADC30-like PRRSV，FJ03与 JXA1、HuN4等HP-PRRSV处于同一进化分支为 HP-PRRSV。FJ10与HB-1 (sh)/2002是处于HP-PRRSV与经典毒株之间的具有中等毒力的毒株 (图2)。

2.2 PRRSV ORF5基因DNA Shuffling结果

DNaseⅠ酶将回收纯化的处于不同遗传分支的ORF5 PCR产物酶切成大小约为50–150 bp左右的片段 (图 3)。以纯化回收后的酶切产物为模板，进行无引物 PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳分析 (图4)。以无引物PCR产物为模板，用引物P3/P4进行有引物PCR扩增，获得大小为500 bp左右的重组ORF5基因片段 (图5)。

图1 PRRSV ORF5基因片段的PCR扩增产物Fig. 1 Amplification of PRRSV ORF5 gene by RT-PCR. M: DL2000 DNA marker；1: PCR product of ORF5 of FJ01; 2: PCR product of ORF5 of FJ03; 3: PCR product of ORF5 of FJZ03; 4: PCR product of ORF5 of FJ10; 5: negative control.

图2 基于PRRSV ORF5构建遗传进化树Fig. 2 Phylogenetic tree based on the ORF5 genes of the 4 isolates and reference viruses.

2.3 序列分析

将回收纯化的有引物扩增的PCR产物连接到pMD-19T载体进行连接转化，挑取 50个阳性克隆进行测序。通过DNAstar软件对测序结果进行分析，△2ORF5基因包含4株PRRSV (FJZ03、FJ01、FJ03和FJ10) 的部分ORF5基因片段，最终选取△2ORF5作为目的基因 (图6和图7)。

图3 ORF5基因的DNaseⅠ酶切结果Fig. 3 Identification of PRRSV ORF5 by DNaseⅠdigestion. M: DL2000 DNA marker; 1–3: product of DNaseⅠdigestion.

图4 ORF5基因的无引物PCR扩增结果Fig. 4 Amplification of ORF5 by PCR without primers.M: DL2000 DNA marker; 1–6: amplified ORF5 without primers.

图5 利用P3/P4引物扩增去除信号肽区域的△ORF5基因Fig. 5 Amplification of without signal peptide region△ORF5 by PCR using specific primers P3/P4. M:DL2000 DNA marker; 1–6: amplified △ORF5 by PCR using specific primers P3/P4; 7: negative control.

2.4 重组△2ORF5蛋白的纯化

将鉴定为阳性的 pET32a-△2ORF5重组菌加入终浓度为 1 mmol/L IPTG进行蛋白的诱导表达，收集菌体，进行SDS-PAGE分析，结果表明在预期位置出现明显的条带 (42 kDa)，与预计大小一致，最佳诱导时间为5 h。重组蛋白经蛋白纯化系统纯化后，通过SDS-PAGE分析，结果表明纯化的蛋白纯度较高，纯化效果理想 (图8)。

2.5 多克隆抗体Western blotting分析

四株毒株未纯化的重组 pET32a-ORF5蛋白经 SDS-PAGE和 PVDF膜转印后，与鼠源抗△2ORF5血清作用，再经羊抗鼠IgG HRP二抗作用，Western blotting分析，在预期位置出现明显的条带 (42 kDa)，与预计大小一致，而空质粒pET-32a未见目的条带 (图 9)，说明表达的蛋白可被鼠源抗△2ORF5血清所识别。

2.6 病毒感染抑制试验

将△2ORF5多抗血清进行倍比稀释，检测不同稀释度血清 (2-2-2-6) 对4株PRRSV感染Marc-145细胞的抑制率。结果表明多抗血清对4株病毒呈现不同程度的抑制作用，当多抗血清稀释度为 2-2时，其对病毒感染细胞的抑制率最大 (>53%)，随着稀释度的增加呈现下降的趋势，当稀释度达2-6时，对病毒没有抑制作用 (图10A)。接种4株PRRSV对照组细胞病变明显，表明制备的△2ORF5血清具有较好的抗病毒感染活性。抗FJ01、FJ03、FJZ03和FJ10的GP5抗血清对4株PRRSV的抑制试验表明，多抗血清对同源株病毒有较好的抑制作用，而对其他3个异源毒株的抑制作用较差 (图 10B–E)。

图6 △2ORF5与4株亲本毒株ORF5基因核苷酸 (A) 和GP5氨基酸 (B) 序列分析Fig. 6 Alignment of the ORF5 nucleotide sequences (A) and GP5 amino acid sequences (B) among the four parental virus strains and the △2ORF5 chimera.

图7 应用DNA shuffling技术产生的嵌合体△2ORF5核苷酸序列示意图Fig. 7 A schematic diagram of the chimeric ORF5 nucleotide sequences in △2ORF5 generated by DNA shuffling.

图8 重组△2ORF5蛋白的纯化结果Fig. 8 Purification of the recombinant △2ORF5 protein. M: low molecular weight protein marker; 1–3:elution of recombinant △2ORF5 protein from Ni-NTA agarose for three times; 4: pET-32a induced 4 h.

图9 重组蛋白的Western blotting分析结果Fig. 9 Western blotting analysis of the recombinant protein. M: protein molecular weight marker; 1: pET32a-FJZ03-ORF5; 2: pET32a-FJ01-ORF5; 3: pET32a-FJZ03-ORF5; 4: pET32a-FJZ03-ORF5; 5: pET-32a as control.

图10 △2ORF5 (A)、FJ01 (B)、FJ03 (C)、FJZ03 (D) 和FJ10 (E) 多抗血清的病毒感染抑制试验Fig. 10 Inhibition assay of anti-PRRSV infection by polyclonal serum △2ORF5 (A), FJ01 (B), FJ03 (C), FJZ03 (D)and FJ10 (E).

3 讨论

PRRS是危害猪群的主要疾病，主要的预防措施是使用疫苗接种。目前使用的疫苗主要包括弱毒活疫苗和灭活疫苗，这两种疫苗均对该疾病有一定预防作用。弱毒疫苗具有免疫力强、免疫保护期长、保护率高、免疫剂量小、在动物体内诱导免疫抗体产生速度快等优点。但是其在安全性方面依然存在一定问题，接种弱毒活疫苗后可能会经胎盘感染胎儿，并且存在弱毒疫苗返强风险[18-20]。因此弱毒活疫苗可用于存在PRRS的猪群中使用而不建议在未发生PRRS的猪群中使用。而灭活疫苗的使用则相对安全许多，其在使用中不存在安全性问题，但是灭活疫苗在灭活过程中会造成抗原表位缺失或抗原减弱，且抗体产生较慢，需要大剂量、重复接种。大部分疫苗只对同一进化分支的毒株具有一定的保护力，对于不同遗传分支或亲缘关系较远的毒株可能不具有保护作用。目前国内猪场PRRSV呈现复杂多样性，新毒株不断出现，尤其HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV给猪场带来严重的经济损失。研究表明目前市场上的几种弱毒疫苗不能对新出现的NADC30-like PRRSV产生免疫保护作用[21]。因此有必要开发新的基因工程疫苗，使其能够有效、快速地在猪体内产生抗体并能产生广泛的免疫保护作用。

国内外学者利用 DNA shuffling技术定向筛选出具有多个亲本基因特征的突变基因，并将其构建到不同毒株或疫苗株的骨架中，动物实验证实利用DNA shuffling技术构建的PRRSV嵌合病毒可以诱导机体产生针对异源毒株的交叉中和抗体[22-26]，说明DNA shuffling技术在开发有效的针对异源毒株保护的PRRSV疫苗方面具有广阔的前景。ORF5基因编码的GP5蛋白作为PRRSV主要的结构蛋白，具有良好的免疫原性，是研发PRRSV基因疫苗的重要候选蛋白。本研究利用 DNA shuffling技术，将多个处于不同遗传分支的PRRSV ORF5基因进行基因改造，首先利用PCR技术扩增不同PRRSV ORF5基因，将其等量混合后利用DNaseⅠ酶将其酶切成多个 50-150 bp随机的小片段，在无引物的条件下，进行PCR循环，各个片段互为模板和引物进行 DNA链的延长，逐渐重聚成新的全长基因，再使用基因两侧的引物扩增去掉信号肽的 ORF5基因，成功获得了与预期片段相符的ORF5基因片段。通过测序进行序列筛选，获得同时包含4株毒株 (FJZ03、FJ01、FJ03和FJ10) ORF5部分基因的重组△2ORF5基因。Western blotting和病毒感染抑制试验结果表明重组蛋白多抗血清对亲本 PRRSV具有较好的生物学活性，能够与处于不同进化分支的亲本毒株发生反应，不仅可用于不同亚群的 PRRSV检测，还为进一步研究新型PRRSV疫苗奠定基础。

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