抗、感绿豆象绿豆种子差异蛋白的分离与鉴定

成小芳，王宏民，张耀文，张仙红

1 山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801

2 山西农业大学 文理学院，山西 太谷 030801

3 山西农业大学 经济管理学院，山西 太谷 030801

4 山西省农业科学院 作物科学研究所，山西 太原 030000

绿豆象Callosobruchus chinensisL.，属鞘翅目 (Bruchidae) 豆象科(Coleoptera)。主要危害绿豆Vigna radiata、豌豆Pisum sativum、豇豆Vigna unguiculata、红小豆Vigna angularis等食用豆类，尤对绿豆危害最为严重[1]。植物在长期进化过程中形成了一定的抗虫机制，目前已知参与抗虫防御体系的物质主要有氰化物、生物碱、萜烯和蛋白质[2-3]。Sugawara等曾从完全抗豆象的绿豆野生种TC1966中分离出2种环肽生物碱，认为它们与抗豆象有关[4]，但后来Kaga等否认了环肽生物碱抗豆象的观点[5]；Kaga 等从TC1966中分离出一种对豆象有毒性的肽化合物“GIF-5”；Lin等发现一种富含半胱氨酸的 VRCRP (Vigna radiata cysteine rich protein) 蛋白，该蛋白对绿豆象幼虫有致死作用[6]。

蛋白质组学及其技术已成为蛋白质组功能和应用研究的基本手段。其中，聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 (Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE) 以其在同一块胶上可同时分离数千甚至上万种蛋白的优势，在蛋白质组学研究中一直处于核心地位[7]；肽质量指纹图谱是近年来采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测量法 (Matrix-assistedlaser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)发展起来的新型技术，其优点是操作简便、灵敏度高、与很多蛋白分离方法相匹配，运用这两大技术可研究不同时空领域发挥功能的蛋白质组。因此，这些蛋白质组学技术已成为对差异蛋白质进行比较和鉴定的主要方法。

前期研究表明，绿豆晋绿7号和B20对绿豆象具有高抗性[8]，这些抗虫绿豆是否是由于某些特殊蛋白而对绿豆象具有抗性作用目前还未见报道。为初步了解抗虫绿豆抗绿豆象的生理生化机制，选取对绿豆象抗性有显著差异的3个绿豆品种作为研究对象，采用 2-DE比较分析抗、感绿豆象绿豆种子中的差异蛋白，并结合MALDI-TOF MS技术和蛋白质数据库检索，进行抗、感绿豆象绿豆种子中差异蛋白的研究，以期为明确抗虫绿豆的抗虫成分提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试绿豆

绿豆品种晋绿7号 (92%抗虫)、B20(100%抗虫)、潍绿2117 (100%感虫) 由山西省农业科学院作物研究所提供。

1.1.2 主要试剂及仪器

蛋白酶抑制剂PMSF为Amresco公司产品；十二烷基磺酸钠、三氟乙酸、胰酶为Promega公司产品；低熔点琼脂糖、胶条覆盖油为Usb产品。真空干燥机 (上海一恒科学仪器有限公司DZF-6020)、扫描仪 (MICROTEK ScanMaker i800)、电泳槽 (GE ETTAN DALTsix)、分光光度计 (上海沛欧 318C+)、冷冻离心机 (湘仪H5050R)、超声仪 (宁波新芝生物科技股份有限公司 Ningbo Scientz Biotechnology Co., LTD JY96-Ⅱn)、 等 电 聚 焦 仪 (GE ETTAN IPGPHOR3)、Autoflex speed™ MALDI-TOF-TOF质谱仪 (德国布鲁克Bruker Dalton)。

1.2 方法

1.2.1 绿豆蛋白样品制备

将绿豆研成粉末后，加入含等体积Tris饱和酚蛋白的提取液，振荡离心后，取上清，再加醋酸铵甲醇溶液振荡，取沉淀–20 ℃过夜，次日离心并弃上清，用甲醇和丙酮分别洗涤沉淀，将沉淀室温干燥即得蛋白质团块，–80 ℃保存备用。

1.2.2 一向等点聚焦

蛋白溶解后，Bradford法定量测定蛋白[9]，依定量所得数据取相应量的蛋白质，分析胶 (银染) 和质谱胶 (考染) 的上样量分别为120 μg和1 200 μg。干胶条室温20 ℃泡胀12 h后记录胶条号码。一向等电聚焦，程序为：S1 stp 500 V 1 h，S2 grd 1 000 V 1 h，S3 grd 8 000 V 3 h，S4 stp 8 000 V 5.36 h，整个聚焦过程中所用总电压约为60 kVh。等电聚焦完成后，置于平衡管，于–70 ℃保存胶条。

1.2.3 二向SDS-PAGE

灌胶器装好并调节水平后，加入 12.5%SDS-PAGE凝胶液，用饱和正丁醇压平液面，凝固过夜。各平衡管加平衡液平衡2次后，进行二向电泳，程序为：S1 2 W/gel 60 min，S2 17 W/gel直到溴酚蓝迁移至凝胶底部。每个样品重复3次，凝胶采用银染和考染法染色。

1.2.4 图像采集与分析

凝胶采用256灰阶透视扫描模式，于分辨率为200 dpi的扫描仪上扫描后，使用ImageMaster 2D platinum 5.0 (GE) 软件对凝胶进行分析。

1.2.5 质谱鉴定

将差异蛋白点挖出，置于离心管进行胶内酶切、肽段抽提、点靶后利用 Autoflex speed™MALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱分析，flexAnalysis软件 (Bruker Dalton) 过滤基线峰、识别信号峰，并采用BioTools (Bruker Dalton) 软件搜索NCBI数据库获得蛋白质相关信息。

2 结果与分析

2.1 抗、感绿豆种子总蛋白的双向电泳分离图谱

预实验中，采用pH 3–10的IPG胶条对感虫绿豆潍绿2117进行双向电泳 (图1)，结果显示，绿豆蛋白主要分布在pH 4–7范围内，因此，为提高双向电泳图谱的分辨率，选用pH 4–7的IPG胶条对抗、感绿豆进行双向电泳。经多次实验，构建了分辨率高、重复性较好的抗虫绿豆 (晋绿7号、B20) 和感虫绿豆 (潍绿 2117) 的蛋白质二维电泳图谱 (图2)。由图2可知，供试绿豆的蛋白质在2个方向都得到较好的分离，且较低含量的蛋白也能清晰显现出来。

图1 感虫绿豆潍绿2117种子蛋白质的2-DE图谱Fig. 1 2-DE maps of seed proteins from susceptible mungbean Weilv 2117 to bruchids.

2.2 抗、感绿豆差异蛋白点的质谱鉴定与分析

对抗、感 3组绿豆的 2-DE图谱 (图 2) 进行ImageMaster 2D platinum 5.0 (GE) 软件凝胶自动匹配和蛋白点差异筛选，结果显示，2个抗虫绿豆品种晋绿7号和B20蛋白表达量都上调的蛋白点共有28个，表达量上调2.5倍以上的共15个蛋白点，其中，达到10 000倍的有2个，分别为B47和B49，其余各点仅表现为量的差异 (图 3) (每个蛋白点的量是指构成这个点的所有像素强度值的总和)。

图2 抗虫绿豆与感虫绿豆种子蛋白的 2-DE图谱 (第一向用 pH4-7的胶条等电聚焦，第二向采用 12.5%的SDS-PAGE进行分离，A、B、C分别代表潍绿2117号、晋绿7号、B20)Fig. 2 2-DE maps of seed proteins from resistance and susceptible mungbean to bruchids. The first dimension was run using a pH gradient from 4 to 7, and the second dimension was a 12.5% SDS-PAGE. A, B and C corresponding to Weilv 2117, Jinlv No. 7, B20.

对15个差异蛋白点经切胶后挖点、脱色、还原及进一步的烷基化回收，并用胰蛋白酶酶解，抽提酶解肽段进行萃取和ZipTip脱盐处理，并利用 MALDI-TOF MS质谱对获得的蛋白进行肽质量指纹图谱鉴定分析。通过UniProt数据库鉴定，抗虫品种蛋白表达量为感虫品种10 000倍的2个蛋白斑点中只有 B49得到成功鉴定，为 8S球蛋白；超过2.5倍被成功鉴定出共 5个蛋白点，分别为B13、B31、B34、B41和B56 (表1)。其中，B13、B49和B56属同一种蛋白质，均为8S球蛋白α亚型，B56和B49具有相同的等电点和分子量，而B13与它们只是等电点相同而分子量不同；B34为8S球蛋白β亚型，与前3个蛋白点的等电点和分子量均不相同；蛋白点B31为1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶亚基结合蛋白，作为陪伴蛋白帮助RuBis CO在体内正确折叠组装；B41为合成淀粉酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂的前体多肽链。还有2个分子量相同而等电点不同的未知蛋白 (B20、B21)，另外7个蛋白点 (B58、B48、B47、B38、B25、B12、B39) 在 UniProt数据库中没有得到验证。

图3 抗、感绿豆种子差异蛋白点 (箭头所指为差异蛋白点)Fig. 3 Principal differentiated protein spots from insect-resistant and insect-susceptible mungbean. The differentiated spots are marked by arrows.

表1 抗、感绿豆种子差异蛋白点的鉴定结果Table 1 Identification of differentially expressed protein spot s from insect-resistant and insect-susceptible mungbean

3 讨论

目前，双向电泳和质谱技术已成为生物学领域对细胞或组织内蛋白质进行分离和鉴定的核心技术。本研究采用双向电泳和质谱技术，结合UniProt蛋白质数据库，成功鉴定出抗、感虫绿豆的15个差异蛋白点，其中抗虫绿豆与感虫绿豆蛋白表达差异为10 000倍的蛋白点有2个，分别为α亚型8S球蛋白和未知蛋白；抗虫绿豆与感虫绿豆蛋白表达差异为23倍的蛋白点有1个，是核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶 (RuBis CO) 亚基结合蛋白。

据报道，8S球蛋白α亚型与大豆β伴大豆球蛋白约有61%的序列一致性，与大豆β伴大豆球蛋白 β肽链序列有 71.4%的一致性[10-11]。大豆抗原中的主要致敏因子β伴大豆球蛋白可导致饲料中的蛋白质利用率降低，而不利于畜禽的生长发育，尤其是对于低龄动物，因其肠道发育不成熟，严重者会引起小肠绒毛脱落[12]。在本研究中，抗虫绿豆品种中4个8S球蛋白α亚型及β亚型的表达量均为感虫绿豆2.5倍以上，其中一个8S球蛋白α亚型蛋白点达10 000倍，推测抗虫绿豆中8S球蛋白α亚型及β亚型可能与大豆β伴大豆球蛋白有同样的作用，影响到绿豆象对蛋白的吸收利用，尤其是在卵发育为幼虫初期，严重影响了幼虫对营养的正常吸收，从而阻碍了绿豆象的正常生长发育。我们的前期实验表明，当绿豆象取食抗虫绿豆后，绿豆种子内存在大量低龄死亡幼虫，且成虫羽化率显著下降[13]，推测可能与这些抗虫品种中含有较多的抗虫性8S球蛋白有关。

核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶伴侣蛋白(RuBis CO), 即分子伴侣60 (Cpn60)，也能作为细胞表面受体与各种配体和细菌作用，作为毒素发挥作用[14-17]。据报道，昆虫体内的RuBis CO伴侣蛋白与细菌的生长繁殖密切相关[18-20]。在本试实中，抗虫绿豆 RuBis CO伴侣蛋白表达量是感虫绿豆的23倍，当绿豆象取食抗虫绿豆后其体内RuBis CO伴侣蛋白增多，是促进了绿豆象体内细菌的繁殖，或与其他配体结合形成毒素导致绿豆象发育受阻甚至死亡，还有待进一步验证，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶伴侣蛋白与绿豆象的互作机制还有待进一步研究。

胰蛋白酶抑制剂 (Trypsin inhibitor，TI) 是一类具有抑制胰蛋白酶活性的多肽或蛋白质，也是参与抗虫防御体系中最重要的蛋白质之一[21]。据报道，豇豆籽粒内所含的胰蛋白酶抑制剂对四纹豆象生长发育有很好的阻滞作用，且对其他鳞翅目和部分鞘翅目害虫如玉米根甲Diabroticaundocinpunctata、棉铃象甲Anthonomus grandis、杂拟谷盗Tribolium confusum等也有抑制作用[22]。Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂 (BBI) 可抑制甜菜夜蛾Spodoperaexigua幼虫肠道内的胰蛋白酶活性，使幼虫体重变轻、发育历期延长[23]。BBI对棉铃虫Helicoverpa armigeraHubner的抗营养效应在于它激活和抑制了棉铃虫体内的蛋白酶活性，导致其体内蛋白酶之间的相互协调性遭到破坏，使进入中肠的蛋白质不能有效消化吸收，从而使昆虫的正常生长发育受阻[24]，据报道，绿豆胰蛋白酶抑制剂Lys片段活性中心序列在体外成功地合成了对furin蛋白有强抑制活力的16肽[25]，表明胰蛋白酶抑制剂的前体加工酶的前体肽具有特异性抑制剂的功能。本研究中，抗虫绿豆合成胰蛋白酶抑制剂的前体物质含量显著高于感虫绿豆，其抗虫作用可能是这些前体物质本身或其在绿豆象体内合成蛋白酶抑制剂抑制了绿豆象体内的蛋白酶活性，从而使绿豆象的生长发育受到影响。

综上所述，在抗、感虫绿豆中差异较大的蛋白点8S球蛋白α和β亚型、RuBis CO伴侣蛋白及胰蛋白酶抑制剂的前体，在抗虫绿豆中存在的作用可能是作为抗虫物质中一种单独作用或几种物质联合作用，影响了绿豆象的生长发育甚至导致死亡，这些差异蛋白与抗虫性的量效关系及联合效应还需要进一步验证。

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