冬凌草甲素联合顺铂对宫颈癌SiHa细胞凋亡及FOXL2、Ki67表达的影响

王彦秋

0 引言

宫颈癌(Cervical cancer)是发生于女性生殖器的一种恶性肿瘤，其中85%的宫颈癌患者分布在发展中国家，严重威胁女性生命安全[1]。目前，治疗宫颈癌的主要方法是手术清除辅以放化疗治疗，顺铂(Cisplatin，DDP)是常用的化疗药物之一[2]。近年研究发现，某些宫颈癌患者易对顺铂产生耐药性[3]。冬凌草甲素(Oridonin，ORI)因其具有调节免疫、抗氧化、抗炎症等药理活性[4]，已作为一种抗肿瘤中药应用于乳腺癌[5]、肺癌[6]等恶性肿瘤的治疗。目前，尚未见关于联合采用冬凌草甲素、顺铂治疗宫颈癌的相关研究。因此,本研究通过观察冬凌草甲素、顺铂联合用药对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响，探讨其机制，试图为临床治疗宫颈癌提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人宫颈癌SiHa细胞，购自中科院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂与仪器 冬凌草甲素(纯度>98%)，购自上海麦克林生化科技有限公司；顺铂注射液，购自江苏豪森药业公司，批准文号：H20040813；DMSO、DMEM培养基、链霉素、青霉素，购自美国Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒、MTT试剂盒，购自碧云天公司；96孔板(Bio-Rad)；反转试剂盒、Trizol试剂、反转录试剂、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)，购自日本Takara公司；蛋白裂解buffer；BCA试剂盒，购自美国Thermo公司；抗体，购自美国CST公司。CO2培养箱；日本Sanyo公司；Elx800酶标仪，购自Bio-Rad公司；Thermal Cycler Dice Real Time System，购自日本Takara公司；荧光显微镜，购自美国Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人宫颈癌SiHa细胞系，加入DMEM培养基(含15%胎牛血清)进行培养，加入链霉素(100 μg/mL)和青霉素(100 U/mL)防止细菌污染，于CO2培养箱(5% CO2，37 ℃)进行培养，所有操作在无菌条件进行，收集进入对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2 MTT实验检测SiHa细胞增殖情况 采用MTT实验对冬凌草甲素和顺铂单独作用SiHa细胞增殖情况进行检测。将对数期SiHa细胞(1.0×105个/孔)接种至96孔板，培养24 h后分别加入冬凌草甲素(4、8、16、32、64 μg/mL)、顺铂(1、2、4、8、16 μg/mL)处理SiHa细胞，同时设置冬凌草甲素空白对照组(加入等量0.1% DMSO)和顺铂空白对照组(加入等量0.9%生理盐水)。分别在作用12、24、36、48、60、72 h后，收集细胞，按照MTT试剂盒说明书进行操作，使用全自动酶标仪检测570 nm波长下各孔细胞吸光值(OD)。计算不同药物浓度对SiHa细胞的生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(1-药物处理组吸光值/对照组吸光值)×100%。每个浓度设置4个重复，实验重复3次。

1.2.3 MTT实验检测冬凌草甲素联合顺铂作用SiHa细胞增殖情况 根据“1.2.2”项所得细胞生长抑制率曲线，结合临床冬凌草甲素和顺铂的使用剂量，选择冬凌草甲素的最适用药浓度：32 μg/mL；顺铂的最适用药浓度：4 μg/mL。将对数期SiHa细胞(3.0×105个/孔)接种至96孔板，培养24 h后将SiHa细胞分为4组：对照组(0.1% DMSO)、冬凌草甲素组(32 μg/mL)、顺铂组(4 μg/mL)、冬凌草甲素联合顺铂组，分别加入相应药物，作用48 h后收集细胞，按照“1.2.2”项方法，计算不同药物对SiHa细胞的生长抑制率。细胞增殖率(%)=药物处理组吸光值/对照组吸光值×100%，每组设置4个重复，实验重复3次。

1.2.4 流式AnnexinV-FITC/PI双标法检测宫颈癌SiHa细胞凋亡情况 收集冬凌草甲素、顺铂单独或联合处理的SiHa细胞(参见“1.2.3”项)，严格按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒说明书，逐步进行操作，利用流式细胞仪进行检测，采用BD FACSDiva Software对试验结果进行采集并分析。每组设置4个重复，实验重复3次。

1.2.5 Hoechest33258染色法检测细胞凋亡 收集冬凌草甲素、顺铂单独或联合处理的SiHa细胞(参见“1.2.3”项)，按照Hoechest33258荧光染色法说明进行操作，置于荧光显微镜下观察SiHa细胞形态。在340 nm激光下，活细胞呈均匀弥散蓝色荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。

1.2.6 qRT-PCR检测宫颈癌SiHa细胞FOXL2、Ki67 mRNA水平 收集冬凌草甲素、顺铂单独用药和联合用药处理的细胞(参见“1.2.3”项)，Trizol法提取总RNA，并检测其浓度和质量。按照反转录试剂盒说明，反转录合成cDNA。FOXL2、Ki67 mRNA表达水平按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)操作说明，在Takara荧光定量PCR仪上进行检测。反应体系总体积10 μL∶cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 6 μL，dH2O 2 μL。按反应条件进行扩增：95 ℃，3 min；95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；40个循环。扩增标准曲线结果显示，R2≥0.98，扩增效率0.95～1.1，表明引物扩增效率高且特异性符合标准。每个浓度做3个重复。采用2-ΔΔCT法，对qRT-PCR结果进行表达差异分析。FOXL2、Ki67及内参基因GAPDH qRT-PCR引物，如表1所示。

表1 FOXL2、Ki67、GAPDH qRT-PCR引物

1.2.7 Western blot检测宫颈癌SiHa细胞FOXL2、Ki67蛋白水平 收集冬凌草甲素、顺铂单独用药和联合用药处理的细胞(参见“1.2.3”项)，加入蛋白裂解buffer(含有protease inhibitor Cocktail)，提取各组细胞总蛋白。采用BCA蛋白试剂盒对细胞中总蛋白含量进行测定。以GAPDH蛋白表达水平作为内参，采用Western blot对细胞中FOXL2、Ki67蛋白水平进行检测。采用Tanon 6100图像分析系统对Western结果拍照并进行定量分析。

2 结果

2.1 冬凌草甲素、顺铂单独用药对SiHa细胞增殖的影响 与对照组比较，16、32、64 μg/mL冬凌草甲素能显著抑制SiHa细胞增殖，32 μg/mL冬凌草甲素作用SiHa细胞48 h，对细胞生长抑制率达52.7%±1.6%(见图1A)。与对照组比较，4、8、16 μg/mL顺铂均能显著抑制SiHa细胞增殖，8 μg/mL顺铂作用SiHa细胞，对细胞生长抑制率为50.9%±4.7%(见图1B)。据此，本研究选择冬凌草甲素32 μg/mL、顺铂4 μg/mL作用48 h，进行后续实验。

2.2 冬凌草甲素联合顺铂抑制SiHa细胞增殖 MTT法检测发现，冬凌草甲素联合顺铂组细胞增殖率为27.33%±4.98%，显著低于冬凌草甲素组55.00%±5.03%、顺铂组59.00%±5.77%、对照组102.30%±4.49%，差异有统计学意义(P<0.05)；冬凌草甲素组、顺铂组细胞增殖率均明显低于对照组(P<0.05)(见图2)。根据活细胞数计算得出冬凌草甲素和顺铂CDI为0.01。

图1 冬凌草甲素、顺铂单独用药对SiHa细胞增殖的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；A.不同浓度冬凌草甲素对SiHa细胞增殖的影响，B.不同浓度顺铂对SiHa细胞增殖的影响

2.3 冬凌草甲素联合顺铂促进SiHa细胞凋亡 流式细胞仪检测结果见图3，冬凌草甲素联合顺铂组细胞凋亡率为31.47%±2.24%，显著高于冬凌草甲素组11.40%±1.01%、顺铂组19.30%±1.03%、对照组4.90%±0.87%，差异均有统计学意义(P<0.05)；冬凌草甲素组、顺铂组细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.05)。

图2 冬凌草甲素联合顺铂用药对SiHa细胞增殖的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与冬凌草甲素组比较，#P<0.05；与顺铂组比较，△P<0.05

图3 冬凌草甲素联合顺铂用药对SiHa细胞凋亡的影响

注：A～D：流式AnnexinV-FITC/PI双标法检测各组细胞凋亡情况(A.对照组，B.冬凌草甲素组，C.顺铂组，D.冬凌草甲素联合顺铂组)；E：冬凌草甲素、顺铂单独或联合用药，SiHa细胞凋亡情况定量分析。与对照组比较，*P<0.05；与冬凌草甲素组比较，#P<0.05；与顺铂组比较，△P<0.05

Hoechest33258染色结果可见，与对照组比较，冬凌草甲素组、顺铂组及冬凌草甲素联合顺铂组部分细胞出现细胞质固缩，细胞核碎裂(见图4)，其中联合用药组中呈现凋亡状态的细胞数目显著多于单独用药组。

2.4 冬凌草甲素联合顺铂促进FOXL2 mRNA和蛋白表达 如图5所示，与对照组比较，冬凌草甲素组、顺铂组、冬凌草甲素联合顺铂组FOXL2 mRNA和蛋白水平均显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)；与冬凌草甲素组比较，冬凌草甲素联合顺铂组FOXL2 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05)；与顺铂组比较，冬凌草甲素联合顺铂组FOXL2 mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05)。

图4 SiHa细胞Hoechest33258荧光染色结果

2.5 冬凌草甲素联合顺铂抑制Ki67 mRNA和蛋白水平 与对照组比较，冬凌草甲素、顺铂单独及联合用药组Ki67 mRNA和蛋白水平均显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)；与冬凌草甲素组比较，联合用药组Ki67 mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05)；与顺铂组比较，联合用药组Ki67 mRNA和蛋白水平显著下降(P<0.05)。见图6。

图5 冬凌草甲素联合顺铂用药对SiHa细胞FOXL2 mRNA和蛋白水平的影响

图6 冬凌草甲素联合顺铂用药对SiHa细胞Ki67 mRNA和蛋白水平的影响

3 讨论

随着国内外对宫颈癌诊治技术的不断改进和完善、宫颈癌发病趋于年轻化，使得保留患者生育能力的要求和可能性逐渐提高。因化疗在宫颈癌中取得的肯定疗效，现已逐渐成为综合治疗宫颈癌的重要手段之一[8]。本研究以宫颈癌SiHa细胞为研究材料，观察冬凌草甲素、顺铂联合用药对SiHa细胞凋亡的影响，并对冬凌草甲素联合顺铂作用后细胞中FOXL2、Ki67 表达水平进行检测，以揭示其作用机制，为冬凌草甲素、顺铂联合应用于宫颈癌的临床治疗提供一定理论依据。

冬凌草甲素是分离自唇形科植物冬凌草的一种天然萜类化合物，具有抗氧化、调节免疫、抗病毒等多种药理活性[9]。临床应用表明，冬凌草甲素对细胞的毒副作用小且不易产生耐药性。已有研究发现，冬凌草甲素对肿瘤具有很强的预防和治疗作用，能够抑制肝癌细胞[9]、结肠癌细胞[10]及肺腺癌细胞[11]等多种肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡。Ma等[12]研究表明，冬凌草甲素能有效逆转人卵巢癌细胞对顺铂的耐药性，诱导卵巢癌细胞凋亡。He等[13]研究表明，冬凌草甲素也能逆转胃癌细胞对顺铂的耐药性，诱导细胞凋亡。本研究发现，与对照组和单独用药组比较，冬凌草联合顺铂作用宫颈癌SiHa细胞时，细胞增殖能力显著降低，凋亡能力显著升高。利用CDI对冬凌草甲素和顺铂相互作用的性质进行评价，根据CDI=两药联合组细胞吸光值/冬凌草甲素组细胞吸光值×顺铂组细胞吸光值，得到CDI为0.01[7]，表明冬凌草甲素和顺铂作用性质为协同，且协同作用极显著。

FOXL2是一种近年来新发现的转录因子[14]。研究发现，FOXL2基因突变或异常表达与一些发育性疾病及卵巢颗粒细胞瘤[15-16]、垂体瘤[17]等恶性肿瘤的发生发展密切相关。研究发现，FOXL2基因能够抑制子宫内膜异位症的产生[18]。Liu等[19]研究表明，FOXL2基因在宫颈癌患者癌组织中异常高水平表达，且过表达FOXL2基因能够抑制宫颈癌细胞Hela的增殖，促进其凋亡。本研究发现，冬凌草甲素联合顺铂作用于宫颈癌SiHa细胞时，细胞中FOXL2基因mRNA和蛋白水平都明显上调，显著高于单独用药组和对照组。推测冬凌草甲素通过促进FOXL2基因上调表达，进一步加强顺铂对细胞增殖的抑制作用及其对细胞凋亡的促进作用，提示FOXL2在宫颈癌发生发展过程中可能作为抑癌基因发挥作用。

Ki67蛋白也称MKI67，与细胞增殖密切相关，定位于细胞核，可作为细胞增殖的可靠标记物[20]。已有研究表明，Ki67与乳腺癌[21]、胃癌[22]、宫颈癌[23]的发生发展及预后有关。已有研究发现，Ki67能作为结直肠癌[24]、乳腺癌[25]等恶性肿瘤的分子诊断标记。陈敏丽[26]研究发现，Ki67的表达在宫颈癌中显著增高，与脉管浸润及盆腔淋巴结转移呈现正相关。本研究发现，与对照组和单独用药组比较，冬凌草甲素联合顺铂组Ki67 mRNA和蛋白水平均显著下降。推测冬凌草甲素通过抑制Ki67表达，增强顺铂对细胞凋亡的促进作用。

综上所述，冬凌草甲素能够有效增强顺铂对宫颈癌SiHa细胞的促凋亡作用，推测其机制是通过上调抑癌基因FOXL2表达，下调Ki67表达，从而实现抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。这为冬凌草甲素、顺铂联合应用于治疗宫颈癌的临床推广提供了新依据。

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