脑梗死患者血浆胎盘生长因子水平的变化及意义

刘欢 何国厚 张兆辉 艾志兵

脑梗死是由于动脉粥样硬化大动脉疾病、小动脉疾病(腔隙性脑梗死)或心脏栓塞等原因引起血管严重狭窄或闭塞，供血区脑组织发生缺血性坏死，进而出现局灶性神经功能缺损的脑血管疾病。目前脑梗死的治疗方法主要是通过药物及血管内治疗使血管再通，尽早恢复缺血半暗带的血液供应，保护尚未坏死的神经元，减轻脑水肿，从而有效降低脑梗死的致残、致死率。PLGF是一种主要表达于胎盘中的血管生长蛋白，在心肌缺血等病理状态下其表达明显上调，也可通过调节VEGF的活性间接发挥脑保护作用，因此也被认为是一种很有潜力的治疗缺血性疾病的血管生成因子[1]。目前对PLGF在脑梗死方面的研究十分有限，近年有研究发现PLGF与脑梗死患者预后有关[2]。但对于脑梗死后各时期及不同梗死面积PLGF水平的变化，国内外未见相关报道。本研究通过测定脑梗死患者血浆PLGF水平，来探讨PLGF水平在脑梗死后不同时期和不同梗死面积中的变化及意义，从而为脑梗死诊断、病情严重程度及预后评估提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年2月-2017年7月在十堰市太和医院神经内科住院治疗的92例脑梗死患者(脑梗死组)及46例同期住院的非脑血管病患者(对照组)作为研究对象，脑梗死的诊断参照我国第四届脑血管疾病学术会议修订的脑梗死诊断标准，并经颅脑CT和(或)MRI检查进一步证实。根据脑梗死发病时间长短将脑梗死组分为急性期组和恢复期组，规定急性期组发病时间为7 d内，恢复期组为发病后7～30 d。采用颅脑CT或MRI测定所有脑梗死患者最大梗死直径，根据直径大小将脑梗死患者分为大面积梗死组(≥5 cm)、中面积梗死组(2～5 cm)和小面积梗死组(≤2 cm)。所有纳入对象均签署知情同意书并且需排除以下情况：既往有脑梗死和(或)脑出血病史、近3个月来头部外伤史、严重的肝肾功能异常、血液系统疾病、全身系统感染、肿瘤、自身免疫性疾病、妊娠或哺乳期妇女。

1.2 方法

1.2.1 一般资料记录 记录所有研究对象的年龄、性别、吸烟史、高血压病史、糖尿病史、冠心病史，入院后均行血常规、肝肾功能、凝血功能、血脂、血糖、HCY、hsCRP及颅脑CT和(或)MRI检查。

1.2.2 标本采集及PLGF水平测定 所有研究对象均在入院后第2 d清晨空腹抽取静脉血4 mL，肝素钠抗凝，并在标本采集后30 min内于4 ℃ 1 000 r/min离心15 min，然后取上清置于EP管内，置于-80℃冰箱内保存，避免反复冻融，待所有标本采集完毕后进行集中检测。测定前将PLGF-ELISA试剂盒中所有试剂及标本缓慢均衡至室温(18～25℃)，并在操作前15 min配置好实验所需要的试剂。实验方法：加样(标准品或样本)100 uL，37 ℃孵育1 h；甩干，加检测溶液A 100 uL，37 ℃孵育1 h；洗板3次；加检测溶液B 100 uL，37 ℃孵育30 min；洗板5次；加TMB底物90 uL，37 ℃避光孵育10～20 min；加终止液50 uL，立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔光密度(OD值)，绘制标准曲线，由标准曲线计算出样品水平。

1.2.3 统计学处理

2 结 果

2.1 脑梗死组和对照组一般资料比较

脑梗死组和对照组年龄、性别、吸烟史、高血压病史、糖尿病史、冠心病病史、HDL及LDL水平比较均无明显差异(P>0.05)；脑梗死组TC、TG、HCY、hsCRP、PLGF水平高于对照组(P<0.05)(表1)。

表1 脑梗死组和对照组患者一般资料比较

2.2 不同时期脑梗死患者血浆PLGF水平比较

脑梗死急性期组PLGF水平高于恢复期组，但无明显差异(P>0.05)(表2)。

表2 不同时期脑梗死患者血浆PLGF水平比较)

2.3 不同梗死面积脑梗死患者血浆PLGF水平比较

小面积梗死组血浆PLGF水平明显低于中面积及大面积梗死组(P<0.05)；大面积梗死组血浆PLGF水平明显高于中面积梗死组(P<0.05)(表3)。

3 讨 论

VEGF是第1个被用于研究脑梗死的血管生长因子，它不仅可促进缺血脑组织的血管生成，减少梗死体积，还具有促进神经组织再生和神经保护作用[3-4]。我国学者研究发现脑梗死组患者发病后第2、7及14 d血清VEGF水平均明显高于对照组，说明VEGF可能参与了脑梗死的病理生理过程，且VEGF水平与脑梗死患者的病情轻重及预后密切相关,脑损伤越重、梗死灶体积越大、预后较好,VEGF水平越高[5]。PLGF是由Maglione等人最早在胎盘cDNA库中分离得到的与VEGF结构高度相似的糖化二聚体蛋白，是CPA内皮细胞的促分裂原[6-7]，能和Flt-1/VEGFR-1、神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1，NRP1)和神经纤毛蛋白-2(neuropilin-1，NRP2)受体结合，但不能和Flk-1/VEGFR-2受体结合[7-9]。PLGF作为VEGF家族七大成员之一(还有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F)，对血管生长有着不可忽视的作用，可刺激缺血心肌、肢体的血管发生和动脉生成，刺激成熟非渗漏血管的形成[10]。有研究发现PLGF基因敲除小鼠在全身缺氧情况下脑血管生长反应延迟，生成的血管不稳定，增加脑通透性[11]。Liu等通过MRI和组织学分析发现PLGF诱导血管发生不会引起脑水肿[12]。另外，在受损心肌中也发现PLGF诱导血管生成可避免VEGF引起的一些副作用，如引起水肿、纤维蛋白原沉积、不稳定血管结及肾小球样小体的生成[13-14]。因此，PLGF比VEGF在治疗缺血性疾病方面更具有优势，有望成为治疗缺血性疾病的新型药物。

表3 不同梗死面积脑梗死患者血浆PLGF水平比较)

注：与小面积梗死组比较，*P<0.05;与中面积梗死组比较，#P<0.05

本研究发现，脑梗死患者血浆PLGF水平明显高于对照组，说明PLGF可能参与了脑梗死的病理生理过程。基础研究发现，在正常小鼠脑内PLGF mRNA和蛋白质遍及所有神经元中，而血管和星形细胞中不能表达PLGF。在脑梗死发生后PLGF表达首先在缺血的神经元中上调，在大脑中动脉闭塞(MCAO)后24 h达峰值，随后逐渐下降，在MACO 3 d完全缺乏表达；PLGF mRNA和蛋白质的表达在梗死区及其周围的血管内(MCAO后3 d达峰值)、梗死区的巨噬细胞(MCAO后3～7 d)、缺血边界区的神经元和星形胶质细胞(仅PLGF蛋白)中也发生上调[15]。PLGF在大鼠CNS中表达，尤其在脑缺血后的脑微血管和间质中，还参与到脑缺血过程中，PLGF释放对糖氧剥夺受损神经元具有神经保护作用[16]。Liu等对永久性大脑中动脉闭塞模型大鼠分别静脉转染人类骨髓间充质干细胞(hMSCs)和过多分泌PLGF的hMSCs(PLGF-hMSCs)，发现两种细胞类型均可诱导缺血脑组织内PLGF水平升高，从而减少缺血脑组织体积，增加血管生成，改善受损的神经功能，且PLGF-hMSC发挥的效应更强，说明PLGF在脑梗死后可促进血管生成、保护受损神经细胞[12]。PLGF促进血管生成、营养及保护神经细胞的可能机制如下[17-20]：①直接与Flt-1/VEGFR-1受体结合，刺激特异性酪氨酸残基磷酸化和下游不同靶基因表达，从而促进血管内皮细胞增殖、迁移及分化；②PLGF可以将VEGF从Flt-1/VEGFR-1中分离出来，使VEGF激活Flk/VEGFR-2发挥作用；③PLGF作为一种刺激剂，可增强VEGF与Flk/VEGFR-2结合后产生的生物学效应；④招募对血管生长至关重要的单核细胞及巨噬细胞；⑤动员骨髓中的造血祖细胞；⑥NRP作为VEGF和PLGF的共同受体，在血管生成及神经保护方面也具有重要作用，NRP-1增强了VEGF诱导的内皮细胞趋化性以及VEGF与Flk/VEGFR-2的结合。Carmeliet等发现体内缺乏PLGF会减少缺血肢体、炎症及肿瘤等病理状态下的血管新生、血管渗透性发生和侧枝形成[21]。Luna也发现PLGF基因缺陷小鼠侧支血管和Wills环前部血管数量明显减少[22]，这提示PlGF还可通过促进侧支循环形成来参与脑梗死的病理生理过程。国内学者研究也发现，急性脑梗死患者血浆PIGF水平显著高于对照组，从临床角度说明了PlGF与脑梗死可能具有相关性，且PlGF在不同病因脑梗死的发病机制中权重不同[23]。

本实验结果还显示，脑梗死急性期组血浆PLGF水平明显高于恢复期组，但却没有统计学意义，说明脑梗死患者血浆PLGF水平可能与病程无关。另外，因为本实验规定急性期时间为发病7 d内，所以也有可能是因为血浆PLGF水平在这7 d前已达高峰，随后又逐渐下降，最终保持于和恢复期相当的水平，造成最终2组PLGF水平无统计学差异。因此，后期我们还需对脑梗死患者PLGF水平进行急性期多时间点的检测，探讨PLGF水平在急性期的动态变化。本研究还进一步分析了血浆PLGF水平与不同梗死面积的关系，发现大、小、中梗死面积之间PLGF水平具有显著差异，且具有统计学意义，提示PLGF可能还与脑梗死病情程度有关，即梗死面积越大，病情越重，PLGF水平越高。但本实验样本量仍相对较少，以后还需大量的临床试验证实结果的可靠性。

综上所述，脑梗死患者PLGF水平较非脑血管病患者明显升高，提示PLGF可能通过促进血管生长、营养保护神经、促进侧支形成等多种不同机制参与了脑梗死的病理生理过程；另一方面PLGF水平还与脑梗死面积密切相关，在一定程度上可作为判断脑梗死患者的病情程度的血液学指标。

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