人凝血因子Ⅸ效价测定影响因素的探讨

周仁花

（广东卫伦生物制药有限公司，广东广州 515071）

人凝血酶原复合物（PCC）是由健康人血浆，经DEAE-sephadex A-50凝胶吸附纯化，并经病毒去除和灭活处理，冻干而成的血液制品，主要用于治疗凝血因子Ⅸ缺乏症（乙型血友病）。研发生产人凝血酶原复合物，是进一步充分利用血浆资源的有效途径之一。根据《中国药典》2015年版[1]，人凝血酶原复合物活性成分Ⅸ因子效价测定采用一期法，与英国药典、欧洲药典基本一致。笔者通过实验，总结了不同APTT试剂，不同稀释液、标准与样品复溶后置-20 ℃以下冻存对Ⅸ因子效价测定的影响，结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

（1）人凝血因子Ⅱ、Ⅲ、Ⅸ、Ⅹ国家标准品20010620：中国生物制品检定所。（2）咪唑缓冲液：Thermo公司，135 mL/瓶。（3）APTT试剂：APTTLS（中敏感度 激活剂为鞣花酸）、APTT-XL（高敏感度 激活剂为鞣花酸）、SynthAsil-液体APTT（人工合成磷脂 激活剂为超微细硅）。（4）人凝血因子Ⅸ缺乏血浆：Thermo公司，1 mL/瓶。（5）硫酸鱼精蛋白：西格玛公司Grade X。（6）人凝血酶原复合物样品：300 IU/瓶，10 mL水复溶，广东卫伦生物制药有限公司生产。

1.2 仪器

ACL7000全自动凝血分析仪（美国IL公司）。

1.3 方法

《中国药典》2015年版三部 通则3519中的人凝血因子Ⅸ效价测定法（一期法）。

2 结果与分析

2.1 不同APTT试剂对结果的影响

当标准曲线Ⅸ因子效价为0.1～0.006 25 IU/mL时，分别使用APTT-LS、APTT-XL、SynthAsil-液体APTT测定标准曲线与样品，APTT-LS测得的标准曲线最高点与最低点凝固时间差值较大；3种不同APTT试剂测同一批样品结果均值无显著性差异（P3＞0.05），方差不全相等（P3＜0.05）。数据见表 1、表 2。

2.2 不同稀释液对结果的影响

两种不同稀释液分别是A液（仪器厂家配套供给的稀释液，即咪唑缓冲液，使用0.025 mol/L氯化钙溶液）、B液（中国药典方法规定的稀释液，即A液与3.8%枸橼酸钠按5∶1混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%，使用0.05mol/L氯化钙溶液），分别稀释标准和样品，测得的标准曲线凝固时间差值、样品结果、方差均无显著性差异（P3＞0.05）。数据见表3、表4。

表3 不同稀释液标准曲线凝固时间

表4 不同稀释液测同一批样品实验结果

表1 不同APTT试剂标准曲线凝固时间

表2 不同APTT试剂测得的样品结果

2.3 标准复溶后冻存稳定性

取一支人凝血酶原复合物国家标准品，按说明书复溶后小体积（110 μL/支）分装，置-20 ℃以下冻存，分别于0天（现溶现测）、8天、10天、19天、35天取样测定标准曲线凝固时间，考察稳定性，结果见表5。8天、10天、19天、35天标准曲线与0天比较，无显著性差异（P3＞0.05），表明标准品复溶后置-20℃以下冻存35天对测定结果无影响。

表5 不同贮存时间测得的标准曲线截距、斜率

2.4 样品复溶后冻存稳定性

取一瓶人凝血酶原复合物，按说明书复溶后小体积（1.5 mL/瓶）分装，置-20 ℃以下冻存，分别于0天（现溶现测）、8天、10天、19天、35天取样测定人凝血因子Ⅸ效价，考察稳定性，结果见表6。8天、10天、19天、35天样品结果与0天相比，差值均不超过10%，表明样品复溶后置-20℃以下冻存35天对测定结果无影响。

表6 不同贮存时间测得的样品结果

3 讨论

按瀑布学说，Ⅸ因子效价测定原理是一系列酶促反应，APTT试剂在反应过程中提供催化表面与激活剂[2]，因提供催化表面的磷脂来源不同，激活剂种类不同以及生产厂家不同，不同的APTT试剂对凝血因子的检测敏感性是不同的。从表1、表2结果看，3种APTT试剂测定同一批质控品，结果无显著性差异，但使用APTT-LS试剂重复性优于其他两种试剂，建议购买APTT试剂时，选择在标准曲线范围内高浓度与低浓度凝固时间差值较大的APTT。

从表3、表4结果看，咪唑缓冲液中是否添加枸橼酸钠与白蛋白，两者测得的结果一致，使用仪器厂家配套的稀释液和氯化钙溶液检测Ⅸ因子效价也是可行的。

从表5、表6结果看，将标准和样品复溶后分装，贮存于-20 ℃以下，35天后测定效价无明显变化。因此可以将复溶后的标准品和样品分装后贮存于-20 ℃以下，临用时再解冻，每次使用一支，35天内使用有效。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.四部[M].北京:中国医药科技出版社,2015.

[2]沈琦,云志宏,刘大英.人凝血酶原复合物(PCC)效价测定中几种影响因素的探讨[J].中国输血杂志,1994,7(3):132-134.

[3]孙振球，徐勇勇.医学统计学[M].4版.北京：人民卫生出版社，2014:23-42.