超高效液相色谱法测定垂盆草颗粒中3种黄酮成分的含量

华燕青，张楠

(1.杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100;2.西安市食品药品检验所，陕西 西安 710065)

垂盆草(SedumsarmentosumBunge)为景天科植物，全草入药，具有清热解毒，活血利湿的功效，可用于治疗带状疱疹，毒蛇咬伤、烫伤、烧伤及急慢性肝炎湿热淤结症[1]。垂盆草中富含垂盆草苷、黄酮类、三萜类、生物碱等多种化学成分[2]。研究表明[3-4]，垂盆草总黄酮是垂盆草中重要的保肝降酶作用的活性成分之一，垂盆草总黄酮中含有槲皮素、山柰素、木犀草素、苜蓿苷、槲皮苷、金丝桃苷、木犀草苷、异鼠李素等多种黄酮类化合物。垂盆草颗粒为现行2015年版药典一部收载品种[5]，其含量测定采用紫外-可见分光光度法，以芦丁为对照测定了垂盆草颗粒中总黄酮含量。未分别对各成分进行定量分析。为了客观评价药品的质量，本研究自2015年12月至2016年6月建立了一种超高效液相色谱方法，同时测定垂盆草颗粒中三种黄酮类成分的含量，该方法高效准确灵敏，可为提升垂盆草颗粒质量标准提供参考。

1 仪器与试药

DIONEX UltiMate3000 超高效液相色谱仪，四元分析泵，全自动进样器，柱温箱，UV检测器，Chromeleon7.2工作站，BT124S型电子天平(德国赛多利斯)，1号垂盆草颗粒(杭州华东医药集团康润制药有限公司)批号：150303，150502，2号垂盆草颗粒(上海静安制药有限公司)批号：150915-2，150409-2。对照品：槲皮素(批号100081-201408)，山柰素(批号110861-201310)，异鼠李素(批号110860-201109)，对照品均购于中国药品生物制品检定所，供含量测定使用，甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件色谱柱Thermo Scientific AcclaimTM RSLC 120 C18(2.1 mm×100 mm，2.2 μm)，流动相：甲醇-0.4%磷酸(50 ∶50)；流速：0.3 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：360 nm；进样量：1 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 分别精密称取对照品槲皮素、山柰素、异鼠李素适量，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得对照品储备液，分别精密量取上述储备液适量，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL约含0.513 0 mg的槲皮素，0.254 5 mg的山柰素，0.260 5 mg 的异鼠李素的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液 精密称取垂盆草颗粒2.0 g，置索氏提取器中，精密加入甲醇-25%盐酸溶液(4 ∶1)的混合溶液25 mL，称定质量，加热回流提取1 h，取出放冷后，再称定质量，用甲醇-25%盐酸溶液(4 ∶1)的混合溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3阴性对照溶液 按垂盆草颗粒制剂工艺方法，制备缺垂盆草的阴性样品，按“2.2.2”项下制备方法，制成阴性对照溶液。

2.3系统适用性试验分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各1 μL, 在“2.1”色谱条件下测定，理论板数分别以槲皮素、山柰素、异鼠李素计为18 000、10 015、9 800，各相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，阴性样品对3个黄酮类成分的测定无干扰。各组分基线分离良好。色谱图见图1。

2.4线性范围、最低检测限和定量限分别精密量取“2.2.1”项下的混合对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μL，置于1 mL量瓶中，加入甲醇定容，摇匀，作为系列对照溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进样测定各成分的峰面积积分值，以对照品的进样量(μg)为横坐标，对应的峰面积积分值为纵坐标进行线性回归，槲皮素、山柰素、异鼠李素回归方程及相关系数等见表1，三种成分峰面积与进样量的线性良好。以3倍噪声(S/N≥3)计算检测限(LOD)，以10倍噪声(S/N≥10)计算最小定量限(LOQ)，结果见表1。

2.5精密度试验取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，测定峰面积，结果槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为0.14%，0.32%，0.75%，表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验取1号垂盆草颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于放置0、2、4、8、12、16、20、24 h时进样测定，记录色谱峰面积，结果槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为0.17%，0.43%，0.82%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7重复性试验精密称取1号垂盆草颗粒，按 “2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰。结果槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为1.24%、1.8%、0.96%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.8加样回收率试验精密称取已测知含量的1号垂盆草颗粒样品9份，每3份为一组，每份约1.0 g，精密称定，按样品含量的80%、100%和120%分别精密加入槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算槲皮素、山柰素、异鼠李素的平均回收率，结果见表2。

注：A为对照品；B为样品；C为阴性样品图1 超高效液相色谱图

成分回归方程R值线性范围/μgLOD/μgLOQ/μg槲皮素Y=465.858X+0.0800.999 950^1 0000.381.21山柰素Y=432.942X-0.3000.999 920^4000.461.26异鼠李素Y=204.272X-2.7710.999 620^4000.751.52

2.9样品含量测定分别称取两个厂家各2批样品适量，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算样品中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量，结果见表3。

3 讨论

目前文献已报道的垂盆草颗粒中黄酮类成分的测定方法有高效液相色谱法[6-8]和紫外-可见分光光度法[3]。超高效液相色谱法[9]是一种采用亚2 μm小颗粒填料的液相色谱技术，根据范德米特方程理论，通过降低颗粒度提高柱效和分析速度，增加分析的通量、灵敏度及色谱峰容量, 与HPLC简单方便的方法转换，可弥补传统高效液相系统的不足。本实验采用超高效液相色谱法进行含量测定，在10 min以内即完成三种黄酮类成分的分离及检测，分析时间缩短了5倍，同时该法的流速仅为0.3 mL·min-1，进样体积为1 μL，流动相用量仅约为28 mL，而高效液相色谱法流速多为1.0 mL·min-1，进样量为10 μL或20 μL，流动相用量较多。因此采取超高效液相色谱法进行测定可节约分析时间，减少溶剂消耗，极大地降低分析成本，提高了检验效率。

表2 加样回收实验(n=9)

表3 样品含量测定结果(n=2)

本研究分别考察了甲醇、70%甲醇、甲醇-25%盐酸(4 ∶1)三种提取溶剂，结果以甲醇-25%盐酸(4 ∶1)为提取溶剂时3种成分的提取效率最高，并考察了索氏热回流法、超声提取法2种提取方式，30 min、45 min、1 h不同提取时间对黄酮成分提取率的影响，结果显示索氏热回流提取样品1 h的提取效率最高，其有效成分含量较高、分离效果好。

参考相关文献[8-10]，分别考察了甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液、甲醇-0.4%冰乙酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液3 种流动相系统，并用多种不同配比进行试验。结果采用甲-0.4%磷酸水(50 ∶50，V/V)为流动相，黄酮类成分色谱峰的峰形及分离效果最好。

综上所述，本研究所建立的超高效液相色谱法快速准确高效，重复性好。可作为控制垂盆草颗粒质量的有效方法。